第一篇：制藥實驗總結(jié)

1、溶液1，2，3，的作用？

溶液Ⅰ的作用：懸浮大腸桿菌菌體，而且加溶液I后，必須要將菌體懸浮徹底，不得有塊狀大顆粒狀呈現(xiàn)，是質(zhì)粒DNA提取的首要關鍵。且其中含有的溶霉菌可以水解菌體細胞壁的主要化學成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌作用。

溶液

2、提供堿性條件，在NaOH與SDS的共同作用下使大腸桿菌瞬間裂解，并變性核DNA。當細胞懸浮于NaOH和十二烷基酸鈉（SDS）溶液中使，在高pH（堿性環(huán)境）的作用下細胞發(fā)生裂解，此外蛋白質(zhì)和染色體DNA發(fā)生變性與細胞碎片一起沉淀下來。溶液3：（醋酸鉀和醋酸），該溶液所含有的高濃度鉀離子與溶液體系中的十二烷基硫酸鈉（即SDS與NaOH所形成的可溶性物質(zhì)）發(fā)生反應形成十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate,PDS），從而將與之結(jié)合的絕大部分大腸桿菌蛋白質(zhì)以及很長的基因組DNA一起沉淀沉淀，與質(zhì)粒分離開來；中和氫氧化鈉使質(zhì)粒DNA復性。

因為基因組DNA太長了，長長的DNA自然容易被PDS給共沉淀了，盡管SDS并不與DNA分子結(jié)合。

2、各試劑的作用？ 溶液

1、葡萄糖的作用是使懸浮后的大腸桿菌不會很快沉積到管子的底部，增加溶液的粘度，維持滲透壓及防止DNA受機械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+ 和Mg2+等二價金屬離的螯合劑，在溶液I中加入EDTA，是要把大腸桿菌細胞中的二價金屬離子都螯合掉，從而起到抑制 DNase對DNA的降解和抑制微生物生長的作用。另外也可保證溶菌酶活性。任何生物化學反應，首先要控制好溶液的pH，因此用適當濃度的和適當pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不過的了

溶液

2、提供堿性條件，在NaOH與SDS的共同作用下使大腸桿菌瞬間裂解，并變性核DNA。當細胞懸浮于NaOH和十二烷基酸鈉（SDS）溶液中使，在高pH（堿性環(huán)境）的作用下細胞發(fā)生裂解，此外蛋白質(zhì)和染色體DNA發(fā)生變性與細胞碎片一起沉淀下來。溶液

3、醋酸中和堿。

25/24/1的酚/氯仿/異戊醇：

A．水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液，離心后酚相會跑到上層，不利于含質(zhì)粒的水相的回收；加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；

B．酚與水有很大的互溶性，如果單獨用酚抽提后會有大量的酚溶解到水相中，而酚會抑制很多酶反應。而且含質(zhì)粒DNA的水相會部分進入到酚中，造成損失！C．添加異戊醇，主要是為了讓離心后上下層的界面更加清晰，方便了水相的回收。

無水乙醇：回收后的水相含有足夠多的鹽，DNA在無水乙醇中的溶解度小，因此只要加入2倍體積的乙醇，在室溫放置幾分鐘后離心就可以將質(zhì)粒DNA沉淀出來。70%乙醇：如果感覺發(fā)生了鹽的沉淀，就用70％的乙醇多洗幾次。（除鹽），3、注意事項

（2）用不新鮮的0.4 M NaOH，即便有SDS也無法有效溶解大腸桿菌。因此必須使用新鮮的0.4 M NaOH試劑進行配制。

（3）SDS易產(chǎn)生氣泡，不要劇烈攪拌。（4）變性時間不宜過長。

（5）用移液器操作時一定要小心，特別是加入溶液二、三后一定不要劇烈震蕩，以免切碎DNA。

質(zhì)粒DNA的酶切鑒定及瓊脂糖凝膠電泳

1、限制性核酸內(nèi)切酶的特性，在基因工程中的作用？ 特性（基因工程）、定義。

作用基因工程的重要工具，能切割DNA獲得目的基因，切割質(zhì)粒留下連接位點。此外，雙切酶能保證基因的定向插入，提高重組率。產(chǎn)生粘性末端惑平末端。

目前, 基因工程上, 限制酶主要應用于以下兩方面

（1）目的基因與載體的重組

細菌細胞中的限制酶能水解外源DNA , 因此必須通過適當?shù)妮d體(質(zhì)?；蚴删w)的幫助才能將外源DNA引人受體細胞并在其中增殖和表達。將供體DNA與載體用同樣的限制酶處理, 使載體帶上各種各樣的外源DNA片斷, 然后引人受體細菌細胞增殖, 菌細胞增殖, 再篩選出所需的菌株, 便獲得帶有某一目的基因的繁殖系.用這種方法, 已成功地將酵母菌的咪哇甘油磷酸脫水酶基因、夕一異丙基蘋果酸脫氫酶基因和色氨酸合成酶基因通過幾噬菌體轉(zhuǎn)人大腸桿菌。2）建造新的基因載體作為基因載體,在引人受體細胞后, 必須有較高的復制率, 以求獲得大量的基因產(chǎn)物；必須具備一個選擇性標志, 以便篩選；還要有一至多種限制酶的作用位點（每種酶只有一個切口）；

2、瓊脂糖凝膠電泳的注意事項?

一、配膠：

1、電子稱的使用，要時刻保持電子稱的精確性，清潔性，根據(jù)不同濃度的膠配置瓊脂糖。

2、加TAE的量要適當，以免配出的膠太薄導致膠孔太淺或濃度太低。

3倒膠前，膠托要洗干凈，并擦干，倒膠時要待膠冷到一定溫度搖勻，盡量不要產(chǎn)生氣泡。若膠的溫度過高要頂著膠托，防止膠變形。

二、點樣電泳

1孔板要干凈，loading點樣要均勻，控制1~2ul的量，并做好對應標記。2點樣后及時蓋上膠墊注意不要蓋反。

5加樣時槍頭要上緊，吸樣均勻準確，排液時槍頭不要有殘留

3點電泳前要檢查膠是否合格，點樣要對準膠孔，盡量點完所有的樣。4不要忘記點marker并擺正膠位，正負極不要接反。

三、EB染色

1切膠要準，取膠要穩(wěn)，泡膠要慎以免EB濺起。2碰到EB的手套要及時丟棄 3 EB要適時更換，盤子及時清洗 4抹布要分清，不可交叉使用。

四、圖像分析儀的使用

1使用前要清潔，避免影響膠圖清新度。2 照膠時應經(jīng)量減少開紫外燈的時間。

5觀察時要帶防護眼鏡，避免眼睛被紫外損傷。

3拍照時先關攝像頭再關紫外燈，嚴格按照照膠流程操作。4照好的膠要及時丟棄。

3、膠回收試劑盒在回收DNA時各試劑的作用？ PCR

一、降低退火溫度對反映有何影響？

1在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。

2如果溫度過低，擴增特異性差，雜帶較多，背景深。PCR擴增在變性階段吸熱,在退火和延伸階段放熱,每一個PCR循環(huán)呈現(xiàn)放熱效應,同時退火溫度高導致平臺期的前移和焓值的降低，4、退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。

二、延長變性時間對反映有何影響？

變性時間延長會導致酶活性的降低。

GC含量過高的片段，可以適當延長變性時間。

三、循環(huán)次數(shù)是不是越多越好？

不是的，隨著反應的進行，酶會逐漸失活、dNTP等原料會逐漸消耗掉。

PCR敏感性太高,循環(huán)過多容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，比方說把試劑中原本極其微量的雜質(zhì)序列片段放大擴增，影響對正常結(jié)果的判斷。

因此在一定范圍內(nèi)，隨著反應循環(huán)數(shù)的增加，產(chǎn)物會增多；但超過了就不好了。一般設置30-35個循環(huán)就很夠了

四、PCR的五大元素？

參加PCR反應的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物：

引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。設計引物應遵循以下原則：

①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。

③引物堿基：G+C 含量，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免核苷酸的成串排列。

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。

⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量：引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。

(2)酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2。5U(指總反應體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。

(3)dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，將其PH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。(4)模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K 來消化處理標本。SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀； 蛋白酶K 能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K 法，要防止RNase降解RNA。

(5)Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產(chǎn)物減少。酵母菌原生質(zhì)體的分離與再生

高壓蒸汽滅菌的注意事項？（微生物實驗）

第一，無菌包不宜過大(小于50cm×30cm×30cm)，不宜過緊，各包裹間要有間隙，使蒸汽能對流易滲透到包裹中央。消毒前，打開貯槽或盒的通氣孔，有利于蒸汽流通。而且排氣時使蒸汽能迅速排出，以保持物品干燥。消毒滅菌完畢，關閉貯槽或盒的通氣孔，以保持物品的無菌狀態(tài)。

第二，布類物品應放在金屬類物品上，否則蒸汽遇冷凝聚成水珠，使包布受潮。阻礙蒸汽進入包裹中央，嚴重影響滅菌效果。

⑥瓶裝液體滅菌時，要用玻璃紙和紗布包扎瓶口；如有橡皮塞時，應插入針頭排氣；⑦應有專人負責，每次滅菌前，應檢查安全閥的性能，以防壓力過高發(fā)生爆炸，保證安全使用；

第二篇：生物技術制藥總結(jié)

生物技術：人們以現(xiàn)代生命科學為基礎，結(jié)合先進的工程技術手段和其他基礎科學的科學原理，按照預先的設計改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達到某種目的的技術

1基因工程制藥：利用基因重組技術將外援基因?qū)胨拗骶蚣毎M行大規(guī)模培養(yǎng)，以獲得蛋白質(zhì)藥物的過程。

2.載體：是攜帶外源目的基因或DNA進入宿主細胞，實現(xiàn)外援基因或DNA的無性繁殖或表達有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。

細胞傳代passage：將細胞從一個培養(yǎng)器皿中消化、分散并接種至另一個培養(yǎng)器皿中的操作。細胞克隆培養(yǎng)（clonal culture）：即單細胞分離培養(yǎng)，是將動物組織分散后，將一個細胞從群體細胞中分離出來，由單個細胞培養(yǎng)成純系細胞集群。

動物細胞的復蘇：其原則是快速融化，必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結(jié)晶，對細胞造成損害。

細胞融合（cell fusion）：是指在外力（誘導劑或促融劑）作用下，兩個或兩個以上的異源（種、屬間）細胞或原生質(zhì)體相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合并形成雜種細胞的現(xiàn)象，或稱細胞雜交。

轉(zhuǎn)基因動物（transgenic animal）：采用基因工程技術將外源目的基因?qū)雱游锷臣毎?、胚胎干細胞和早期胚胎，并在受體動物的染色體上穩(wěn)定整合，在經(jīng)過發(fā)育途徑將外源目的基因穩(wěn)定地傳給子代，通過這項技術所獲得的動物即為轉(zhuǎn)基因動物。

胚胎干細胞（embryo stem cell）：簡稱ES細胞，是從早期胚胎細胞團分離出來并能在體外培養(yǎng)的一種高度未分化的、具有形成所有成年細胞類型能力的全能干細胞。它是正常二倍體型，像早期胚胎細胞一樣具有發(fā)育上的全能性。

抗體工程制藥（antibody engineering pharmaceutics）：利用基因工程、細胞工程（包括動物細胞工程和植物細胞工程）和轉(zhuǎn)基因動物及轉(zhuǎn)基因植物技術生產(chǎn)抗體藥物的過程。

單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）：簡稱單抗，將能大量擴增和永生的骨髓瘤細胞和能合成分泌特異性抗體的B細胞（僅識別一種抗原表位）進行融合得到雜交瘤細胞，經(jīng)篩選和克隆化的雜交瘤細胞僅能合成及分泌抗單一抗原表位的特異性抗體。

雜交瘤細胞克隆化（cloning）：是指將陽性孔中分泌抗體的單個細胞分離出來。融合后的雜交瘤細胞一般要經(jīng)過3次克隆化才能達到100%的陽性克隆。

雙特異性抗體（bispecific antibody，bsAb）：亦稱雙功能抗體，是含有兩個不同配體結(jié)合位點的抗體分子，它有兩個不同的抗原結(jié)合部位（兩個臂），可分別結(jié)合兩種不同的抗原表位。嵌合抗體（chimeric antibody）：是利用DNA重組技術，將異源單抗的輕、重鏈可變區(qū)基因插入含有人抗體恒定區(qū)的表達載體中，轉(zhuǎn)化哺乳動物細胞表達的抗體，表達的抗體分子中輕、重鏈的V區(qū)是異源的，而C區(qū)是人源的，即整個抗體分子的60%~70%是人源的。

人源化抗體（humanized antibody，hAb）：通過CDR移植即把鼠抗體的CDR（互補決定區(qū)）序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi)所得到的抗體，也稱CDR移植抗體或改型抗體。該抗體既具有鼠源性單抗的特異性又保持了人抗體的功能（C區(qū)的功能）。

免疫原性（immunogenicity）：抗原能刺激機體特異性免疫細胞，使其活化、增值、分化，最終產(chǎn)生免疫效應物質(zhì)（抗體或致敏淋巴細胞）的特性。

免疫反應性（immunoreactivity）：抗原與相應免疫效應物質(zhì)在體內(nèi)或體外相遇時，可發(fā)生

特異性結(jié)合而產(chǎn)生免疫反應的特性。

減毒活疫苗（live attenuated vaccine）：是通過不同的方式手段使病原體的毒性即致病

性減弱或喪失后獲得的一種由完整的微生物組成的疫苗制品。

滅活疫苗（inactivated）：是將病原體經(jīng)培養(yǎng)增殖、滅活純化處理，使其完全喪失感染性，但保留了病原體的幾乎全部組分因此滅活疫苗具有較好的免疫原性和安全性。

亞單位疫苗（subunit vaccine）：利用微生物的某種表面結(jié)構(gòu)成分（抗原）制成、能誘發(fā)

機體產(chǎn)生抗體的疫苗。

分解代謝阻遏（catabolite repression）：在菌體的生長階段被菌體快速利用的碳源會產(chǎn)

生大量的分解產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物阻遏次級代謝酶系的合成，只有當這類碳源被消耗完后，阻遏作用被消除，菌體才由生長階段轉(zhuǎn)入次級代謝產(chǎn)物合成階段，這種發(fā)酵過程中的次級代

謝產(chǎn)物在碳源被消耗盡時才產(chǎn)生和積累的現(xiàn)象稱為分解代謝阻遏。

生物技術：人們以現(xiàn)代生命科學為基礎，結(jié)合先進的工程技術手段和其他基礎科學的科學原

理，按照預先的設計改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達到某種目的的技術。

種齡（inoculumage）：種子罐中培養(yǎng)的菌絲轉(zhuǎn)入下一級種子罐或發(fā)酵罐時得培養(yǎng)時間

生物技術藥物的特性？

（1）理化性質(zhì)特性（1）相對分子量大（2）結(jié)構(gòu)復雜：蛋白質(zhì)和核酸均為生物大分子，蛋

白質(zhì)含有四級結(jié)構(gòu)（3）穩(wěn)定性差（2）藥理學作用特性（1）活性與作用機制明確：活性物

質(zhì)對生理功能的調(diào)節(jié)機制比較清楚（2）作用針對性強：有特定的靶分子、靶細胞或靶器官

（3）毒性低：生物技術藥物本身是體內(nèi)天然存在的物質(zhì)或它們的衍生物（4）體內(nèi)半衰期短

（5）有種屬特異性（6）可產(chǎn)生免疫原抑制（3）生產(chǎn)制備特性（1）藥物分子在原料中的含量低（2）原料液中常存在降解目標產(chǎn)物的雜質(zhì)：應采取快速分離純化的方法以除去影響

目標產(chǎn)物穩(wěn)定性的物質(zhì)（3）制備工藝條件溫和：目的產(chǎn)物不穩(wěn)定（4）分離純化困難：需要

多種不同原理的層析單元操作才能達到要用的純度（5）產(chǎn)品易受有害物質(zhì)（4）質(zhì)量控制特

性

質(zhì)粒的特點：（1）是指獨立于原核生物染色體之外具有自主復制能力的遺傳物質(zhì)。（2）質(zhì)粒

具有遺傳傳遞和遺傳交換的能力（3）質(zhì)粒具有不相容性：兩種親緣關系密切的不同質(zhì)粒不

能在同一宿主細胞中穩(wěn)定共存。4..共價閉合環(huán)狀DNA(ccDNA)，開環(huán)DNA(ocDNA)，線狀

DNA(lDNA)在瓊脂糖凝膠電泳中

5.復制子松弛型復制子的復制和宿主蛋白的合成功能

無關，宿主染色體DNA復制受阻時，質(zhì)粒仍可復制；嚴謹型復制子的復制與宿主蛋白質(zhì)的合成相關，因此在每個宿主細胞中為低拷貝數(shù)，僅1~3個。

6.克隆表達的質(zhì)粒載體涉及三個要素：

（1）復制子（2）選擇標記：由質(zhì)粒攜帶的賦予宿主細胞新的表型的基因，用于鑒定和篩選

轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒的宿主細胞。常見的標記：氨芐西林（Amp），卡那霉素（Kan）（3）多克隆位點

（MCS）：質(zhì)粒載體中由多個限制性內(nèi)切酶識別序列密集排列形成的序列。

7.目的基因常用制備方法

(1)化學合成法（2）PCR法：在含有DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTP的緩沖溶液中通

過下列步驟擴增DNA：a）變性：雙鏈DNA模板加熱變性，解離成單鏈模板；b）退火：降

低溫度，引物與單鏈模板結(jié)合；c）延伸：溫度調(diào)整至DNA聚合酶最適宜溫度，最終與單鏈

模板形成雙鏈，并開始下一個變性、退火、延伸循環(huán)。（3）基因文庫法（4）cDNA文庫法

8.影響目的基因與載體之間連接效率的主要因素：

9.（1）DNA片段之間的連接方式：粘性末端的連接效率高于平頭末端。（2）目的基因與載

體的濃度和比例：增加DNA濃度可以提高連接效率，目的基因與載體DNA的摩爾數(shù)比應大

于1.（3）連接溫度、時間、連接酶的活性及緩沖液。

9.重組DNA導入大腸桿菌，常用的感受態(tài)細胞制備方法：氯化鈣法

10.重組子的篩選與鑒定：

（1）載體遺傳標記法：a)抗生素抗性篩選法

b)互補篩選法：重組子轉(zhuǎn)化成宿主細胞，載體的表達產(chǎn)物與宿主細胞中營養(yǎng)缺陷性突變發(fā)生

互補作用，從而實現(xiàn)重組子的篩選。藍白斑篩選：lacZα基因可編碼β—半乳糖苷酶α氨基

端的α互補肽段，與宿主細胞編碼的缺陷型β—半乳糖苷酶α實現(xiàn)互補，可分解底物5-溴-4-

氫-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，形成藍色菌落。由于lacAα基因的插入失活而成白色，空載體的宿主細胞呈藍色。c)營養(yǎng)缺陷篩選法d噬菌斑篩選法(2)核酸分子雜交法

(3)限制性內(nèi)切酶圖譜法(4)DNA序列測定法：雙脫氧終止法(5)目的基因表達產(chǎn)物測定法

12.外源基因在大腸桿菌中的表達形式：

(1)胞內(nèi)表達：(a)非融合蛋白的胞內(nèi)表達：形成包涵體（B）融合蛋白的胞內(nèi)表達：在大腸桿

菌內(nèi)較穩(wěn)定（2）分泌表達：（a)分泌至周質(zhì)（b）分泌至胞外

11.外源基因在原核生物中表達的重要調(diào)控元件

(1)啟動子：是DNA鏈上能與RNA聚合酶結(jié)合并起始mRNA合成的一段序列，是決定外源基

因在原核生物中表達效率的關鍵因素。(2)核糖體結(jié)合位點：SD序列(3)終止子

13.大腸桿菌中外源蛋白表達效率的影響因素：(1)外源基因密碼子：偏好密碼子（蛋白質(zhì)合成迅速，錯配率低）和稀有密碼子(2)mRNA結(jié)構(gòu)：減少G、C含量，增加A、T含量(3)表達

載體：高拷貝數(shù)、適用范圍廣、穩(wěn)定性高、表達產(chǎn)物容易純化(4)外源蛋白穩(wěn)定性

14.分離純化技術應滿足下列要求：(1)技術條件要溫和，能保持目的產(chǎn)物的生物活性；(2)選

擇性要好(3)回收率要高(4)兩個技術之間要能直接銜接(5)整個分離純化過程要快

15.基因重組蛋白的主要分離技術

(1)離心(2)沉淀(3)膜分離(4)雙水相萃取

16基因重組蛋白的主要純化技術:

(1)離子交換層析(2)親和層析(3)凝膠過濾層析(4)反相層析和疏水層析

17.選擇分離純化方法的依據(jù)：

（元，層析分離次序的選擇也同樣重要。(3)根據(jù)分離純化工藝的要求來選擇(a)具有良好的穩(wěn)

定性、重復性和較高的安全性(b)盡可能減少組成工藝的步驟(c)分離純化工藝所用的時間要

盡可能的短(d)工藝和技術必須高效

18．基因工程藥物的質(zhì)量控制要點

(1)蛋白質(zhì)含量的測定(2)蛋白質(zhì)純度檢測(3)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量測定(4)蛋白質(zhì)等電點測定(5)蛋

白質(zhì)序列分析(6)內(nèi)毒素分析、宿主蛋白與核酸殘留分析

19.蛋白質(zhì)含量的測定

(1)紫外吸收法(2)BCA法(3)Lowry法(4)考馬斯亮藍法(5)SDS-PAGE掃描分析法

20.蛋白質(zhì)純度的檢測：電泳法、層析法、質(zhì)譜法、末端氨基酸殘基分析法

21.蛋白質(zhì)Mr測定有SDS-PAGE法、凝膠層析法、質(zhì)譜法

22.蛋白質(zhì)等電點測定的常用方法：等電聚焦法。

23.蛋白質(zhì)序列的分析:N-端氨基酸序列分析，C-端氨基酸序列分析

根據(jù)體外培養(yǎng)時動物細胞對生長基質(zhì)的依賴性，可將動物細胞分為

(1)貼壁依賴性細胞(2)非貼壁依賴性細胞(3)兼性貼壁細胞

1.動物細胞培養(yǎng)的環(huán)境條件

(1)培養(yǎng)溫度（哺乳類37℃，昆蟲25~28℃）(2)pH值（大多數(shù)7.2~7.4）(3)通氧量（一定量的CO2）(4)防止污染(5)基本營養(yǎng)物質(zhì)(6)滲透壓

3.動物細胞的培養(yǎng)特性

(1)比微生物細胞大得多，無細胞壁，抗機械強度低，對剪切力敏感，適應環(huán)境能力差；(2)

倍增時間長，生長緩慢，正常二倍體細胞的生長壽命是有限的；(3)對培養(yǎng)基要求高，易受

微生物污染，培養(yǎng)時需要添加抗生素；(4)生長大多需貼附于基質(zhì)，相互粘連以集群形式存

在，并有接觸抑制現(xiàn)象；(5)多半將產(chǎn)物分泌在細胞外，便于收集和純化；(6)對蛋白質(zhì)的合成條件和修飾功能與細菌不同，動物細胞可對蛋白質(zhì)進行完善的翻譯后修飾，特別是糖基化，與天然產(chǎn)品更一致，更適合于臨床應用。

4.原代培養(yǎng)的主要步驟

(1)從健康動物體內(nèi)無菌條件下取出適量組織，剪切成小薄片；(2)加入適宜濃度的胰蛋白酶

或膠原酶和EDTA等進行消化作用使細胞分散；(3)將分散的細胞進行洗滌并純化后，以2×

10^6~7×10^6 /ml的濃度加到培養(yǎng)基中，37℃下進行原代培養(yǎng)，并適時進行傳代培養(yǎng)。分為

組織塊培養(yǎng)和單層細胞培養(yǎng)兩種方法。

5.動物細胞深低溫保存的基本原理

在-70℃以下時，細胞內(nèi)的酶活性均已停止，即代謝處于完全停滯狀態(tài)，故可以長期保存。

在不加任何條件下直接凍存細胞時，細胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內(nèi)發(fā)

生機械損傷、電解質(zhì)濃度升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白質(zhì)變性等，能引起細胞

死亡。目前為了保存細胞，都采用液氮低溫（-196℃）凍存的方法。

6.動物細胞的復蘇

其原則是快速融化，必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使細胞外凍

存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結(jié)晶，對細胞造成損害。

7.動物細胞營養(yǎng)要求特點

(1)碳源不能為無機物，大多為葡萄糖；(2)氮源不能為無機物，主要為各種氨基酸；(3)在很

多情況下尚需添加5%~20%的小牛血清或適量的動物胚胎浸出液。

8.動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)方法

(1)懸浮培養(yǎng)法(2)微載體培養(yǎng)法(3)多孔載體培養(yǎng)法(4)微囊化培養(yǎng)法(5)中空纖維培養(yǎng)法

9.誘導動物細胞融合的方法主要有:(1)病毒法(2)PEG法(3)電擊法(4)激光法

10.轉(zhuǎn)基因動物生物反應器（整體掌握？）

(1)轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應器（藥用蛋白，如抗凝血Ⅲ、抗胰蛋白酶、葡萄糖苷酶、C蛋白）

(2)轉(zhuǎn)基因動物血液生物反應器（人血紅蛋白、抗體或非活性狀態(tài)的融合蛋白）(3)轉(zhuǎn)基因動

物尿液生物反應器（促性腺激素）(4)轉(zhuǎn)基因雞（蛋）生物反應器（人干擾素）

1.單克隆抗體技術的基本原理

基于動物細胞融合技術得以實現(xiàn)的，即骨髓瘤細胞和B細胞的融合。骨髓瘤細胞在體外

培養(yǎng)能大量無限增殖，但不能分泌特異性抗體；抗原免疫的B細胞能產(chǎn)生特異性抗體，但在體外不能無限增殖。將免疫B細胞和骨髓瘤細胞融合后形成的雜交瘤細胞，繼承了兩個親代

細胞的特性，既具有骨髓瘤細胞能無限增殖的特性，又具有免疫B細胞合成和分泌特異性抗

體的能力。通常使用HAT（H為次黃嘌呤、A為氨基蝶呤、T為胸腺嘧啶核苷）選擇培養(yǎng)基

對雜交瘤細胞進行篩選。未融合的脾細胞因不能在體外長期存活而死亡，未融合的骨髓瘤細

胞合成DNA的從頭合成途徑被培養(yǎng)基中的A阻斷，又因缺乏HGPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸

核糖轉(zhuǎn)移酶）和TK（胸腺嘧啶核苷激酶），不能利用培養(yǎng)基中的H和T完成DNA的合成過

程而死亡。只有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了HGPRT和TK，因此能在HAT培養(yǎng)基

中長期存活與繁殖并分泌抗體。

2.單克隆抗體的大量制備主要方法:（1）體內(nèi)培養(yǎng)法（2）體外培養(yǎng)法

6.重組ScFv的應用:(1)用于構(gòu)建和生產(chǎn)免疫毒素(2)用于腫瘤的影像分析和治療

7.噬菌體抗體庫技術的基本原理:用PCR技術從人免疫細胞中擴增出整套的VH和VL基因，克隆到噬菌體載體上并以融合蛋白的形式表達在其外殼表面。這樣一來噬菌體DNA中有抗

體基因的存在，同時在其表面又有抗體分子的表達，可以方便地利用抗原-抗體特異性結(jié)合而篩選出所需要的抗體，并進行克隆擴增。

7.噬菌體抗體庫構(gòu)建過程

(1)從外周血或脾、淋巴結(jié)等組織中分離B細胞，提取mRNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA；

(2)應用抗體輕鏈和重鏈引物，根據(jù)建庫的需要通過PCR技術擴增不同的抗體基因片段；

(3)構(gòu)建噬菌體載體；(4)用表達載體轉(zhuǎn)化細菌，構(gòu)建全套抗體庫。

通過多輪的抗原親和吸附（結(jié)合）-洗脫-擴增，最終篩選出抗原特異的抗體克隆。其中，噬

菌體抗體庫的篩選是關鍵環(huán)節(jié)和步驟。

減毒活疫苗的優(yōu)缺點：

優(yōu)點：

（1）通過自然感染途徑接種，可以誘導包括體液免疫、細胞免疫和粘膜免疫在內(nèi)的更全面的免疫應答，使機體獲得更廣泛的免疫保護；（2）由于使用的是活的微生物他們可以在體內(nèi)

長時間起作用而誘導較強的免疫反應，且由于活的微生物有增殖的特性，理論上只需要接

種一次，即可達到滿意的免疫效果；（3）可能引起水平傳播擴大免疫效果，增強群體免疫屏

障；(4)一般不需要再疫苗中添加佐劑，生產(chǎn)工藝一般不需要濃縮純化，價格低廉。

缺點：

(1)一般減毒活疫苗均保留一定殘余毒力，對一些個體如免疫缺陷者可能誘發(fā)嚴重疾病，并

且由于種種原因如基因修飾等，減毒活疫苗可能出現(xiàn)毒力回復即“返祖”現(xiàn)象；(2)減毒活

疫苗是活的微生物制劑，可能造成環(huán)境污染而引發(fā)交叉感染等，并可能滯留在環(huán)境中形成傳

染源；(3)缺損顆?？赡芨蓴_免疫效果，因此產(chǎn)品分析評估較為困難；(4)保存運輸?shù)葪l件要

求較高，如需冷藏等。

1.滅活疫苗的特點：(1)滅活疫苗常需多次接種；(2)接種滅活疫苗產(chǎn)生的抗體滴度隨著時

間而下降；(3)滅活疫苗需要量大。

第七章 發(fā)酵工程制藥

1.發(fā)酵類型：(1)微生物菌體發(fā)酵(2)微生物的酶(3)微生物的代謝產(chǎn)物發(fā)酵(4)微生物轉(zhuǎn)化發(fā)

酵(5)生物工程菌發(fā)酵

2.微生物發(fā)酵生產(chǎn)藥物的分類：(1)抗生素類(2)氨基酸類(3)核苷酸類(4)維生素類(5)甾體類

激素(6)多糖類(6)治療酶及酶抑制劑

3.菌種保藏方法：(1)斜面低溫保藏法(2)石蠟油封存法(3)沙土管保藏法(4)麩皮保藏法(5)甘

油懸液保藏法(6)冷東真空干燥保藏法(7)液氮超低溫保藏法(8)宿主保藏法

4.種子液具備的條件：(1)菌種的生長活力強，轉(zhuǎn)種至發(fā)酵罐后能迅速生長，延遲期短；(2)

生理狀態(tài)穩(wěn)定；(3)菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求；(4)無雜菌污染，保證純種培養(yǎng)；()保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力

5.微生物的發(fā)酵方式：（1）分批發(fā)酵（2）補料—分批發(fā)酵（3）半連續(xù)發(fā)酵（4）連續(xù)發(fā)酵

5.發(fā)酵過程的中間分析項目：（1）產(chǎn)物產(chǎn)量（2）PH值（3）糖（4）氨基氮（5）菌絲形

態(tài)

6.發(fā)酵過程的影響因素及控制：（1）菌體濃度的影響及控制（2）營養(yǎng)物質(zhì)對發(fā)酵的影響

及控制（3）溫度的影響及控制（4）PH的影響及控制（5）溶氧的影響及控制（6）二氧化碳的影響及控制（7）泡沫的影響及控制（8）染菌對發(fā)酵的影響

第三篇：制藥質(zhì)量總結(jié)樣板（定稿）

第一部分 2017工作總結(jié)

一、成績

1、QA團隊管理

2017年QA團隊由年初4人增加到6人。

2、體系管理

2017年結(jié)合公司ISO9001由2008升級到2015，重新修訂和完善公司質(zhì)量管理體系文件。

3、審計管理

2017年接受管理評審、內(nèi)部審核、認證審核、監(jiān)督審核和客戶審核56次。

4、產(chǎn)品質(zhì)量改進/產(chǎn)品質(zhì)量回顧 2017年完成公司36種產(chǎn)品質(zhì)量回顧。

5、放行管理

2017年完成50種物料，30000批次放行；36種中間產(chǎn)品1800批次產(chǎn)品放行；36種產(chǎn)品3600批次放行。

6、驗證管理

2017年完成年初既定的20項驗證項目。

7、生產(chǎn)過程監(jiān)控

2017年按照公司要求完成所有的監(jiān)控項目。

8、偏差/投訴管理

2017年共完成偏差調(diào)查報告20份，其中設備管理方面4份、生產(chǎn)過程5份，其他11份。

9、供應商管理

2017年按照年初計劃完成供應商審計42家。

10、召回/追溯管理

2017年完成模擬召回和追溯演練20批次。

11、變更管理

2017年完成變更16項，其中物料變更2項、設備設施變更7項，其他7項。

12、培訓

2017年按照年初計劃，完成42項培訓。

13、法規(guī)/標準管理

2017年收集和識別法律法規(guī)12項目，并將其轉(zhuǎn)化為公司相關文件并實施。

14、計量管理

2017年新成立計量室后，按照國家相關計量法規(guī)對公司計量器具進行管理，其中送外檢62次，內(nèi)部校驗260次。

15、其他

配合公司其他部門完成相關工作。

二、不足

1、QA團隊成員知識和能力略顯不足

2、計量管理與技能不足

3、驗證管理知識欠缺

4、偏差管理不足

三、改進

1、針對QA人員職責和知識水平，制定和實施相關知識培訓。

2、加外部計量管理知識和技能培訓

3、參加外部驗證和偏差管理培訓

第二部分 2018工作計劃 1、2018年管理評審、內(nèi)部審核（自檢）計劃 2、2018年體系轉(zhuǎn)版計劃 3、2018年驗證計劃 4、2018年供應商審計計劃 5、2018年項目變更計劃 6、2018年質(zhì)量培訓計劃 7、2018年檢定/校驗計劃 8、2018年產(chǎn)品質(zhì)量改進計劃

第四篇：制藥綜合設計性實驗指導書

制藥工程專業(yè) 化學制藥綜合實驗指導書

生命科學與工程學院制藥工程專業(yè)

指導教師：常相娜

2011年3月

化學制藥綜合實驗實施方案

化學制藥綜合實驗是依據(jù)藥物制藥工程專業(yè)培養(yǎng)方案及教學大綱的要求編定，本實驗內(nèi)容涉及藥物制劑專業(yè)多門基礎課和專業(yè)基礎課，包括有機化學、分析化學、藥物化學、藥物合成反應、藥物分析、藥劑學、化學制藥工藝學等課程內(nèi)容。要求學生針對指導教師所下任務書，查找相關文獻，對藥物的合成路線、工藝條件、制劑形式及制備條件各方面的內(nèi)容自行設計，可行性論證通過后，獨立實施由原料到原料藥，最后得到相應制劑的全過程。通過本次設計性實驗，培養(yǎng)學生查閱資料，綜合文獻的初步能力，在此基礎上選擇合成路線，擬定實驗方案，獨立進行實驗，提高學生獨立工作能力、分析和解決的能力，從而加深對制藥工程專業(yè)系統(tǒng)課程基本理論和基本知識的認識和理解，為學生的就業(yè)及學業(yè)深造奠定實踐基礎。

一、目的

化學制藥綜合實驗的目的主要是讓學生通過資料查閱、合成路線的設計、合成實驗的操作、實驗結(jié)果純度和產(chǎn)率的分析鑒定、工藝條件考察及制劑的制備，學到一套系統(tǒng)、完整的對化學藥物的合成路線、合成過程合理性、合成產(chǎn)物的分析鑒定的方法、工藝可行性及制劑的制備。并通過此項訓練，提高學生動手操作能力，提高學生獨立思考、分析問題、解決問題的能力。

二、方案

1.設定目標：依據(jù)所給出的藥物的初步合成方案結(jié)合查閱的資料及常用臨床化學藥物的合成方法來設計具體藥物合成步驟、工藝考察方案及制劑制備方法，使學生掌握：

（1）．化學藥物合成中的常用反應如酯化反應、格氏反應、乙?；磻?；（2）．熟悉藥物合成中對藥物的結(jié)構(gòu)修飾基本過程，了解有機合成的水解、蒸餾、重結(jié)晶、攪拌、回流、萃取、過濾等基本操作；

（3）．掌握工藝考察中因素、水平確定方法及實驗因素水平表的建立的方法；（4）．熟悉常見藥物制劑的類型及一般的制備方法。

2.目標實施： 按照兩人一小組實驗，每九個小組為一大組共同完成一個藥物的工藝條件考察實驗。程序為：

（1）．每個學生自行查閱相關文獻資料，獨立設計方案題目；

（2）．個組討論，確定可實施的合成路線、工藝考察因素表及制劑處方設計；（3）．教師審核并提出或設計問題，題目組針對問題修正設計路線、工藝考察表及制劑處方設計；

（4）．題目組自行完成實驗結(jié)果；

（5）．分析討論并提出進一步研究的更完善的和合成路線、工藝考察表及制劑處方設計。

制藥工程綜合設計性實驗任務書

（一）一、題目：貝諾酯的制備及工藝條件考察

二、實驗任務

1.查閱與貝諾酯合成工藝及制劑相關的圖書資料及文獻資料。2.依據(jù)任務書各組提出相應的方案，應包括：

a.目的意義；

b.合成部分：合成步驟、工藝流程、需要儀器與試劑、實驗設備裝置圖、定性分析方法；

c.工藝考察部分：因素水平的確定、正交實驗表； d.制劑部分：配方、操作流程。3.論證方案可行性，確定合理方案。4.完成設計實驗論文并提交產(chǎn)品。

5.對所得數(shù)據(jù)進行分析，完成設計實驗論文。

三、實驗要求

1.實驗中要求學生不完全依賴現(xiàn)成條件，能在教師指導下自己創(chuàng)造一些條件完成實驗。

2.實驗的方案應合理、簡單，并具有一定創(chuàng)新性。3.實驗數(shù)據(jù)準確，須注明實驗條件。

4.要求提供的樣品袋上注明樣品名稱、熔點、純度、制備者、日期。

四、設計實驗論文內(nèi)容 1.題目； 2.藥物概述；

3.所完成合成與制劑過程的實驗操作、工藝要點、注意事項； 4.實驗所用試劑規(guī)格及用量、儀器的型號及生產(chǎn)廠家； 5.自制或創(chuàng)造了哪些實驗條件； 6.結(jié)果與分析； 7.討論；

8.合理化建議（自選）；

9.在所完成實驗的基礎上提出一個新的研究課題（自選）。

附：貝諾酯初步合成方案

（一）乙酰水楊酰氯的制備

在干燥的100 mL圓底燒瓶中，依次加入吡啶2滴，阿司匹林10 g，氯化亞砜5.5 mL，迅速按上球形冷凝器（頂端附有氯化鈣干燥管，干燥管連有導氣管，導氣

冷至室溫即可得到白色的乙酰苯胺固體。

2.抽濾收集：將上步所得固體與母液混合物抽濾分離，固體用少量冷水洗滌2次，抽干，于表面皿上用紅外燈干燥，以便進行下步反應。

（二）乙酰苯胺氯磺化

按圖4-5裝好反應裝置，稱取5.0g干燥的乙酰苯胺置于干燥的250mL三頸瓶中，再在分液漏斗中加入20mL氯磺酸。

氯磺化反應裝置圖

開啟水泵，減壓抽氣，在冷水浴下慢慢將20mL氯磺酸滴入三頸瓶中（約1滴/秒），立即可以看到有大量HCl氣體產(chǎn)生，待滴加完畢，乙酰苯胺溶解消失，水浴加熱（80℃左右）15～20min。打開安全閥，連通大氣，然后依次用冷水、冰水冷卻三頸瓶。

將冷卻的反應液轉(zhuǎn)移到原滴液漏斗中，然后在三頸瓶中加入約100g碎冰塊，再按裝置圖安裝好，三頸瓶外部用冰冷卻，開啟水泵，將反應液滴入三頸瓶中（約需15min），滴畢生成大量的沉淀。

抽濾，壓干即得對-乙酰氨基苯磺酰氯固體，立即進行下一步反應。

（三）對-乙酰氨基磺酰氯的氨解

將上述抽干的固體轉(zhuǎn)移至100mL小燒杯中，在攪拌下加入15mL濃氨水（若固體量較少，可適當減少氨水用量），反應時大量放熱，當固體溶解又重新生成后，繼續(xù)攪拌10 min。

（四）對-乙酰氨基苯磺酰胺的水解

1.將上步所得反應物加入15mL水，冷卻，加濃鹽酸至pH=1～2，轉(zhuǎn)移至燒瓶中。

2.回流：燒瓶中加2塊沸石，裝上冷凝管，在石棉網(wǎng)上小火加熱回流25min。此時固體應溶解，冷卻后得一幾乎澄清的溶液，如有固體析出，應繼續(xù)加熱回流使反應完全。

3.脫色：于稍冷后的回流液中加約一藥勺（約0.5g）活性炭，繼續(xù)回流5min。4.過濾：回流液趁熱用玻璃漏斗過濾，用一干凈的100mL的燒杯收集濾液。5.中和、沉淀：濾液在攪拌下慢慢加入固體Na2CO3至弱堿性（pH≈8）。此時

至70℃，緩緩滴加濃硝酸12ml，保持反應溫度在70—80℃[1]，滴畢，繼續(xù)保溫反應1h。倒入150m1冰水中，放置1h。抽濾，用水洗滌，得粗品，將粗品加入150ml水加熱至沸待全部溶解，熱過濾，濾液充分冷卻，抽濾，得淡黃結(jié)晶。11．2g(60％)，mp227—230℃

（二）美沙拉嗪的合成（還原）

在裝有電動攪拌器、冷凝管及溫度計的250三口瓶中，加入水60ml，升溫至60℃以上，加入濃鹽酸4.2ml，活化鐵粉[2]4g(0.07mo1)，加熱回流后，交替加入活化鐵粉6g(0.11mo1)和5-硝基-2-羥基苯甲酸10g(0.56mo1)，加畢，繼續(xù)保溫攪拌1h。反應畢，冷卻至80℃后，用40％氫氧化鈉溶液調(diào)至pH堿性，過濾，水洗，合并濾液和洗液，向其中加入保險粉1.3g，攪拌，過濾，濾液用40％硫酸調(diào)至PH 2—3，析出固體，過濾，干燥，得固體粗品6.02g(73.3％)。向粗品中，加水lOOml，濃硫酸4.5ml和活性炭少許，加熱回流數(shù)分鐘，趁熱過濾，冷卻，濾液用15％氨水調(diào)至pH2～3，析出固體，過濾，水洗，于燥，得精品5.32g(64．8％)，mp274℃(dec)。注釋

[1]硝化反應是放熱反應，滴加硝酸時，滴加速度要盡可能慢，同時電熱套的電壓應調(diào)節(jié)合適，以保持反應溫度在70—80℃為宜。，[2]鐵粉活化的方法：將鐵粉10克，水5Oml，置150ml蒸發(fā)皿中，加濃鹽酸0.4m1，煮沸。用水以傾瀉法洗至中性，置水中待用。

第五篇：實驗動物飼養(yǎng)員崗位職責(制藥公司)

1.負責實驗用大動物(犬、猴)的飼養(yǎng)及清潔工作，保證動物能得到相應的照顧。

2.進行動物日常觀察和記錄，及時向主管獸醫(yī)報告發(fā)現(xiàn)的異常。

3.配合實驗需求進行實驗期動物飼養(yǎng)，協(xié)助記錄實驗期動物相關數(shù)據(jù)。