第一篇：制藥質(zhì)量總結(jié)樣板（定稿）

第一部分 2017工作總結(jié)

一、成績(jī)

1、QA團(tuán)隊(duì)管理

2017年QA團(tuán)隊(duì)由年初4人增加到6人。

2、體系管理

2017年結(jié)合公司ISO9001由2008升級(jí)到2015，重新修訂和完善公司質(zhì)量管理體系文件。

3、審計(jì)管理

2017年接受管理評(píng)審、內(nèi)部審核、認(rèn)證審核、監(jiān)督審核和客戶(hù)審核56次。

4、產(chǎn)品質(zhì)量改進(jìn)/產(chǎn)品質(zhì)量回顧 2017年完成公司36種產(chǎn)品質(zhì)量回顧。

5、放行管理

2017年完成50種物料，30000批次放行；36種中間產(chǎn)品1800批次產(chǎn)品放行；36種產(chǎn)品3600批次放行。

6、驗(yàn)證管理

2017年完成年初既定的20項(xiàng)驗(yàn)證項(xiàng)目。

7、生產(chǎn)過(guò)程監(jiān)控

2017年按照公司要求完成所有的監(jiān)控項(xiàng)目。

8、偏差/投訴管理

2017年共完成偏差調(diào)查報(bào)告20份，其中設(shè)備管理方面4份、生產(chǎn)過(guò)程5份，其他11份。

9、供應(yīng)商管理

2017年按照年初計(jì)劃完成供應(yīng)商審計(jì)42家。

10、召回/追溯管理

2017年完成模擬召回和追溯演練20批次。

11、變更管理

2017年完成變更16項(xiàng)，其中物料變更2項(xiàng)、設(shè)備設(shè)施變更7項(xiàng)，其他7項(xiàng)。

12、培訓(xùn)

2017年按照年初計(jì)劃，完成42項(xiàng)培訓(xùn)。

13、法規(guī)/標(biāo)準(zhǔn)管理

2017年收集和識(shí)別法律法規(guī)12項(xiàng)目，并將其轉(zhuǎn)化為公司相關(guān)文件并實(shí)施。

14、計(jì)量管理

2017年新成立計(jì)量室后，按照國(guó)家相關(guān)計(jì)量法規(guī)對(duì)公司計(jì)量器具進(jìn)行管理，其中送外檢62次，內(nèi)部校驗(yàn)260次。

15、其他

配合公司其他部門(mén)完成相關(guān)工作。

二、不足

1、QA團(tuán)隊(duì)成員知識(shí)和能力略顯不足

2、計(jì)量管理與技能不足

3、驗(yàn)證管理知識(shí)欠缺

4、偏差管理不足

三、改進(jìn)

1、針對(duì)QA人員職責(zé)和知識(shí)水平，制定和實(shí)施相關(guān)知識(shí)培訓(xùn)。

2、加外部計(jì)量管理知識(shí)和技能培訓(xùn)

3、參加外部驗(yàn)證和偏差管理培訓(xùn)

第二部分 2018工作計(jì)劃 1、2018年管理評(píng)審、內(nèi)部審核（自檢）計(jì)劃 2、2018年體系轉(zhuǎn)版計(jì)劃 3、2018年驗(yàn)證計(jì)劃 4、2018年供應(yīng)商審計(jì)計(jì)劃 5、2018年項(xiàng)目變更計(jì)劃 6、2018年質(zhì)量培訓(xùn)計(jì)劃 7、2018年檢定/校驗(yàn)計(jì)劃 8、2018年產(chǎn)品質(zhì)量改進(jìn)計(jì)劃

第二篇：仿制藥質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)專(zhuān)題培訓(xùn)總結(jié)

仿制藥質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)專(zhuān)題培訓(xùn)總結(jié)

鄭鵬博

二〇一六年一月二十五日

參加2016年1月23日至24日由陜西藥學(xué)會(huì)及藥檢所組織的《仿制藥質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)專(zhuān)題》聘請(qǐng)國(guó)內(nèi)專(zhuān)家謝沐風(fēng)、陳悅、涂家生等就當(dāng)下最熱門(mén)仿制藥一致性評(píng)價(jià)內(nèi)容進(jìn)行講讀，兩天的培訓(xùn)隊(duì)仿制藥一致性工作開(kāi)展及政策要求有了一定認(rèn)識(shí)，為下一步藥廠(chǎng)與科研對(duì)產(chǎn)品工作開(kāi)展有了較好的前期接入基礎(chǔ)?，F(xiàn)對(duì)培訓(xùn)內(nèi)容總結(jié)如下：

仿制藥評(píng)價(jià)工作內(nèi)容：

仿制藥按與原研藥質(zhì)量和療效一致的原則受理和審評(píng)審批。

全面提高仿制藥質(zhì)量，對(duì)2007年注冊(cè)管理辦法前批準(zhǔn)的仿制藥，國(guó)家基本藥物目錄（2012年版）化學(xué)藥品仿制藥口服固體制劑，應(yīng)在2018年底之前完成一致性評(píng)價(jià)，屆時(shí)沒(méi)有通過(guò)評(píng)價(jià)的，注銷(xiāo)藥品批準(zhǔn)文號(hào)。對(duì)2007年以前批準(zhǔn)上市的其他仿制藥品和2007年以后批準(zhǔn)上市的仿制藥品，自首家品種通過(guò)一致性評(píng)價(jià)后，其他生產(chǎn)企業(yè)相同品種在3年內(nèi)仍未通過(guò)評(píng)價(jià)的，注銷(xiāo)藥品批準(zhǔn)文號(hào)。

仿制藥一致性評(píng)價(jià)下一步工作：國(guó)家提倡體內(nèi)，更鼓勵(lì)體外，因?yàn)轶w外簡(jiǎn)單，節(jié)約，采用分步走，先體外，溶出曲線(xiàn)、雜質(zhì)特征、API晶形、輔料等；后體內(nèi)：BE和大臨床。強(qiáng)調(diào)企業(yè)為主體，按照仿制藥的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量控制，實(shí)行最嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)，最嚴(yán)格的監(jiān)管，最嚴(yán)厲的處罰，最嚴(yán)肅的問(wèn)責(zé)。

目前國(guó)家尚無(wú)具體詳細(xì)的分步實(shí)施細(xì)則，有望下一步推出。

（1）紡織藥品的BSC分類(lèi),確定一致性評(píng)價(jià)實(shí)施要求包括BE豁免；（2）參比制劑目錄的確定

來(lái)源進(jìn)口原研且上市；原研不生產(chǎn)，遴選歐盟或日本等上市產(chǎn)品或國(guó)際公認(rèn)品牌；地產(chǎn)化知名品牌；從國(guó)內(nèi)企業(yè)中樹(shù)立標(biāo)桿。

國(guó)家指定；行業(yè)協(xié)會(huì)組織同品種企業(yè)提出選擇參比制劑意見(jiàn)；企業(yè)自行選擇并備案等方式尚無(wú)明確。

參比制劑的購(gòu)買(mǎi)是統(tǒng)一一次性進(jìn)口，還是企業(yè)自行購(gòu)置。（3）組織實(shí)施參比制劑體外溶出曲線(xiàn)的研究，避免各藥廠(chǎng)（4）各品種分布實(shí)施的安排

（5）對(duì)改劑型、換酸根、改劑量等仿制藥無(wú)參比制劑，如何做，有待實(shí)施細(xì)則出臺(tái)。允許企業(yè)采用體外溶出度試驗(yàn)的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，以后還應(yīng)當(dāng)采取體內(nèi)生物等效性試驗(yàn)的方法進(jìn)行后續(xù)評(píng)價(jià)。

制藥企業(yè)目前的應(yīng)對(duì)：

國(guó)家出臺(tái)政策，再尚無(wú)具體細(xì)則，組織研討時(shí)，企業(yè)如何能走在前列按期通過(guò)一致性評(píng)價(jià)，尚需要盡快組織實(shí)施。

1、按照品種目錄確定自身開(kāi)展評(píng)價(jià)的品種；

2、明確評(píng)價(jià)品種的分類(lèi)及國(guó)家分階段實(shí)施的時(shí)限；

3、確定產(chǎn)品的參比制劑，開(kāi)展前期參比制劑研究；

4、進(jìn)行對(duì)比研究，5、如需調(diào)整工藝處方，展開(kāi)藥劑工作，按照補(bǔ)充申請(qǐng)準(zhǔn)備申報(bào)。

6、完成一致性體外評(píng)價(jià)工作

7、按期申報(bào)資料

8、迎接檢查

9、進(jìn)行BE備案

10、通過(guò)評(píng)價(jià)，嚴(yán)格規(guī)范生產(chǎn)。其他

1、應(yīng)展開(kāi)對(duì)原料的研究，對(duì)于難溶性藥物的口服固體制劑，晶形不同導(dǎo)致的溶解度差異，對(duì)溶出特性產(chǎn)生影響；不同粒度對(duì)溶出曲線(xiàn)的區(qū)分；對(duì)其引濕性、松密度、振實(shí)密度、真密度、粒徑、粒度、熔點(diǎn)、水溶性等應(yīng)做詳細(xì)的研究。關(guān)注主成分，晶形、晶格、粒徑、粒度分布、固有溶出速率

對(duì)輔料影響溶出曲線(xiàn)也應(yīng)進(jìn)行分析研究。

2、確保仿制藥再任何體內(nèi)環(huán)境下即PH值寬范圍下都有一定的崩解，溶出，即對(duì)任何人均有較高的生物利用度，應(yīng)前期評(píng)估（濾膜、溶解度和穩(wěn)定性研究、介質(zhì)、體積、設(shè)備、方法、脫氣、轉(zhuǎn)速、取樣時(shí)間點(diǎn)、取樣、樣品處理等）、方法開(kāi)發(fā)、分析整理、自動(dòng)化、驗(yàn)證確定溶出度試驗(yàn)方法。

3、區(qū)分原研制劑的溶出曲線(xiàn)有區(qū)分力和體內(nèi)外相關(guān)性是最大的難題。應(yīng)進(jìn)行仿制藥與原研制劑體外多介質(zhì)中溶出行為比較，確保生物利用度等效。原研制劑應(yīng)進(jìn)行三批，考察其批波動(dòng)等。

在最具區(qū)分力的溶出介質(zhì)中，增加200轉(zhuǎn)比較研究，防止劑量?jī)A斜，美國(guó)增加有機(jī)溶劑測(cè)定對(duì)比，4、BE不是金標(biāo)準(zhǔn)

因BE試驗(yàn)的是年輕男性，是人體最佳狀態(tài)，有其局限性，通過(guò)BE試驗(yàn)部分仿制藥與原研制劑臨床療效仍然有差距，原研制劑經(jīng)臨床大量患者驗(yàn)證。體外溶出試驗(yàn)均能夠具有相似的溶出曲線(xiàn)，大多數(shù)藥物生物等效，因BE試驗(yàn)昂貴，不可能試驗(yàn)一個(gè)處方，就進(jìn)行一次生物等效性試驗(yàn)，因此應(yīng)進(jìn)行體外多條溶出曲線(xiàn)的相同研究，確保BE的成功率。

緩釋制劑的機(jī)理與原研藥品不同，則無(wú)需強(qiáng)求體外溶出行為一致，只能通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或人體預(yù)BE試驗(yàn)驗(yàn)證處方工藝的合理性。日本不允許仿制藥緩釋制劑機(jī)理不同。

5、溶出儀應(yīng)能夠通過(guò)機(jī)械驗(yàn)證及性能驗(yàn)證，每6個(gè)月應(yīng)進(jìn)行校準(zhǔn)。

6、關(guān)于藥品的不良反應(yīng)：

WHO很早就指出“能吃藥不打針，能打針不輸液”的用藥原則，蓋因“是藥三分毒”，藥物是把雙刃劍，即有七分優(yōu)點(diǎn)，三分缺點(diǎn)，口服因由屏障保護(hù)，安全性較高；輸液直接進(jìn)入血液循環(huán)，人體內(nèi)千變?nèi)f化，其發(fā)生概率很小，但在國(guó)民普及輸液下，概率提高；給藥不良事件與劑量、給藥方案、療程、總劑量、其他基礎(chǔ)特征如腎功能狀態(tài)、人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征如年齡性別種族等、伴隨用藥、藥物濃度，基本與主成分和個(gè)體體質(zhì)差異相關(guān)，與雜質(zhì)無(wú)關(guān)。

第三篇：生物技術(shù)制藥總結(jié)

生物技術(shù)：人們以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進(jìn)的工程技術(shù)手段和其他基礎(chǔ)科學(xué)的科學(xué)原理，按照預(yù)先的設(shè)計(jì)改造生物體或加工生物原料，為人類(lèi)生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達(dá)到某種目的的技術(shù)

1基因工程制藥：利用基因重組技術(shù)將外援基因?qū)胨拗骶蚣?xì)胞進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，以獲得蛋白質(zhì)藥物的過(guò)程。

2.載體：是攜帶外源目的基因或DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)外援基因或DNA的無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。

細(xì)胞傳代passage：將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)器皿中消化、分散并接種至另一個(gè)培養(yǎng)器皿中的操作。細(xì)胞克隆培養(yǎng)（clonal culture）：即單細(xì)胞分離培養(yǎng)，是將動(dòng)物組織分散后，將一個(gè)細(xì)胞從群體細(xì)胞中分離出來(lái)，由單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)成純系細(xì)胞集群。

動(dòng)物細(xì)胞的復(fù)蘇：其原則是快速融化，必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成損害。

細(xì)胞融合（cell fusion）：是指在外力（誘導(dǎo)劑或促融劑）作用下，兩個(gè)或兩個(gè)以上的異源（種、屬間）細(xì)胞或原生質(zhì)體相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合并形成雜種細(xì)胞的現(xiàn)象，或稱(chēng)細(xì)胞雜交。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（transgenic animal）：采用基因工程技術(shù)將外源目的基因?qū)雱?dòng)物生殖細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和早期胚胎，并在受體動(dòng)物的染色體上穩(wěn)定整合，在經(jīng)過(guò)發(fā)育途徑將外源目的基因穩(wěn)定地傳給子代，通過(guò)這項(xiàng)技術(shù)所獲得的動(dòng)物即為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

胚胎干細(xì)胞（embryo stem cell）：簡(jiǎn)稱(chēng)ES細(xì)胞，是從早期胚胎細(xì)胞團(tuán)分離出來(lái)并能在體外培養(yǎng)的一種高度未分化的、具有形成所有成年細(xì)胞類(lèi)型能力的全能干細(xì)胞。它是正常二倍體型，像早期胚胎細(xì)胞一樣具有發(fā)育上的全能性。

抗體工程制藥（antibody engineering pharmaceutics）：利用基因工程、細(xì)胞工程（包括動(dòng)物細(xì)胞工程和植物細(xì)胞工程）和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)生產(chǎn)抗體藥物的過(guò)程。

單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）：簡(jiǎn)稱(chēng)單抗，將能大量擴(kuò)增和永生的骨髓瘤細(xì)胞和能合成分泌特異性抗體的B細(xì)胞（僅識(shí)別一種抗原表位）進(jìn)行融合得到雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)篩選和克隆化的雜交瘤細(xì)胞僅能合成及分泌抗單一抗原表位的特異性抗體。

雜交瘤細(xì)胞克隆化（cloning）：是指將陽(yáng)性孔中分泌抗體的單個(gè)細(xì)胞分離出來(lái)。融合后的雜交瘤細(xì)胞一般要經(jīng)過(guò)3次克隆化才能達(dá)到100%的陽(yáng)性克隆。

雙特異性抗體（bispecific antibody，bsAb）：亦稱(chēng)雙功能抗體，是含有兩個(gè)不同配體結(jié)合位點(diǎn)的抗體分子，它有兩個(gè)不同的抗原結(jié)合部位（兩個(gè)臂），可分別結(jié)合兩種不同的抗原表位。嵌合抗體（chimeric antibody）：是利用DNA重組技術(shù)，將異源單抗的輕、重鏈可變區(qū)基因插入含有人抗體恒定區(qū)的表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的抗體，表達(dá)的抗體分子中輕、重鏈的V區(qū)是異源的，而C區(qū)是人源的，即整個(gè)抗體分子的60%~70%是人源的。

人源化抗體（humanized antibody，hAb）：通過(guò)CDR移植即把鼠抗體的CDR（互補(bǔ)決定區(qū)）序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi)所得到的抗體，也稱(chēng)CDR移植抗體或改型抗體。該抗體既具有鼠源性單抗的特異性又保持了人抗體的功能（C區(qū)的功能）。

免疫原性（immunogenicity）：抗原能刺激機(jī)體特異性免疫細(xì)胞，使其活化、增值、分化，最終產(chǎn)生免疫效應(yīng)物質(zhì)（抗體或致敏淋巴細(xì)胞）的特性。

免疫反應(yīng)性（immunoreactivity）：抗原與相應(yīng)免疫效應(yīng)物質(zhì)在體內(nèi)或體外相遇時(shí)，可發(fā)生

特異性結(jié)合而產(chǎn)生免疫反應(yīng)的特性。

減毒活疫苗（live attenuated vaccine）：是通過(guò)不同的方式手段使病原體的毒性即致病

性減弱或喪失后獲得的一種由完整的微生物組成的疫苗制品。

滅活疫苗（inactivated）：是將病原體經(jīng)培養(yǎng)增殖、滅活純化處理，使其完全喪失感染性，但保留了病原體的幾乎全部組分因此滅活疫苗具有較好的免疫原性和安全性。

亞單位疫苗（subunit vaccine）：利用微生物的某種表面結(jié)構(gòu)成分（抗原）制成、能誘發(fā)

機(jī)體產(chǎn)生抗體的疫苗。

分解代謝阻遏（catabolite repression）：在菌體的生長(zhǎng)階段被菌體快速利用的碳源會(huì)產(chǎn)

生大量的分解產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物阻遏次級(jí)代謝酶系的合成，只有當(dāng)這類(lèi)碳源被消耗完后，阻遏作用被消除，菌體才由生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)入次級(jí)代謝產(chǎn)物合成階段，這種發(fā)酵過(guò)程中的次級(jí)代

謝產(chǎn)物在碳源被消耗盡時(shí)才產(chǎn)生和積累的現(xiàn)象稱(chēng)為分解代謝阻遏。

生物技術(shù)：人們以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進(jìn)的工程技術(shù)手段和其他基礎(chǔ)科學(xué)的科學(xué)原

理，按照預(yù)先的設(shè)計(jì)改造生物體或加工生物原料，為人類(lèi)生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達(dá)到某種目的的技術(shù)。

種齡（inoculumage）：種子罐中培養(yǎng)的菌絲轉(zhuǎn)入下一級(jí)種子罐或發(fā)酵罐時(shí)得培養(yǎng)時(shí)間

生物技術(shù)藥物的特性？

（1）理化性質(zhì)特性（1）相對(duì)分子量大（2）結(jié)構(gòu)復(fù)雜：蛋白質(zhì)和核酸均為生物大分子，蛋

白質(zhì)含有四級(jí)結(jié)構(gòu)（3）穩(wěn)定性差（2）藥理學(xué)作用特性（1）活性與作用機(jī)制明確：活性物

質(zhì)對(duì)生理功能的調(diào)節(jié)機(jī)制比較清楚（2）作用針對(duì)性強(qiáng)：有特定的靶分子、靶細(xì)胞或靶器官

（3）毒性低：生物技術(shù)藥物本身是體內(nèi)天然存在的物質(zhì)或它們的衍生物（4）體內(nèi)半衰期短

（5）有種屬特異性（6）可產(chǎn)生免疫原抑制（3）生產(chǎn)制備特性（1）藥物分子在原料中的含量低（2）原料液中常存在降解目標(biāo)產(chǎn)物的雜質(zhì)：應(yīng)采取快速分離純化的方法以除去影響

目標(biāo)產(chǎn)物穩(wěn)定性的物質(zhì)（3）制備工藝條件溫和：目的產(chǎn)物不穩(wěn)定（4）分離純化困難：需要

多種不同原理的層析單元操作才能達(dá)到要用的純度（5）產(chǎn)品易受有害物質(zhì)（4）質(zhì)量控制特

性

質(zhì)粒的特點(diǎn)：（1）是指獨(dú)立于原核生物染色體之外具有自主復(fù)制能力的遺傳物質(zhì)。（2）質(zhì)粒

具有遺傳傳遞和遺傳交換的能力（3）質(zhì)粒具有不相容性：兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒不

能在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定共存。4..共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(ccDNA)，開(kāi)環(huán)DNA(ocDNA)，線(xiàn)狀

DNA(lDNA)在瓊脂糖凝膠電泳中

5.復(fù)制子松弛型復(fù)制子的復(fù)制和宿主蛋白的合成功能

無(wú)關(guān)，宿主染色體DNA復(fù)制受阻時(shí)，質(zhì)粒仍可復(fù)制；嚴(yán)謹(jǐn)型復(fù)制子的復(fù)制與宿主蛋白質(zhì)的合成相關(guān)，因此在每個(gè)宿主細(xì)胞中為低拷貝數(shù)，僅1~3個(gè)。

6.克隆表達(dá)的質(zhì)粒載體涉及三個(gè)要素：

（1）復(fù)制子（2）選擇標(biāo)記：由質(zhì)粒攜帶的賦予宿主細(xì)胞新的表型的基因，用于鑒定和篩選

轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。常見(jiàn)的標(biāo)記：氨芐西林（Amp），卡那霉素（Kan）（3）多克隆位點(diǎn)

（MCS）：質(zhì)粒載體中由多個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別序列密集排列形成的序列。

7.目的基因常用制備方法

(1)化學(xué)合成法（2）PCR法：在含有DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTP的緩沖溶液中通

過(guò)下列步驟擴(kuò)增DNA：a）變性：雙鏈DNA模板加熱變性，解離成單鏈模板；b）退火：降

低溫度，引物與單鏈模板結(jié)合；c）延伸：溫度調(diào)整至DNA聚合酶最適宜溫度，最終與單鏈

模板形成雙鏈，并開(kāi)始下一個(gè)變性、退火、延伸循環(huán)。（3）基因文庫(kù)法（4）cDNA文庫(kù)法

8.影響目的基因與載體之間連接效率的主要因素：

9.（1）DNA片段之間的連接方式：粘性末端的連接效率高于平頭末端。（2）目的基因與載

體的濃度和比例：增加DNA濃度可以提高連接效率，目的基因與載體DNA的摩爾數(shù)比應(yīng)大

于1.（3）連接溫度、時(shí)間、連接酶的活性及緩沖液。

9.重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌，常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法：氯化鈣法

10.重組子的篩選與鑒定：

（1）載體遺傳標(biāo)記法：a)抗生素抗性篩選法

b)互補(bǔ)篩選法：重組子轉(zhuǎn)化成宿主細(xì)胞，載體的表達(dá)產(chǎn)物與宿主細(xì)胞中營(yíng)養(yǎng)缺陷性突變發(fā)生

互補(bǔ)作用，從而實(shí)現(xiàn)重組子的篩選。藍(lán)白斑篩選：lacZα基因可編碼β—半乳糖苷酶α氨基

端的α互補(bǔ)肽段，與宿主細(xì)胞編碼的缺陷型β—半乳糖苷酶α實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，可分解底物5-溴-4-

氫-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，形成藍(lán)色菌落。由于lacAα基因的插入失活而成白色，空載體的宿主細(xì)胞呈藍(lán)色。c)營(yíng)養(yǎng)缺陷篩選法d噬菌斑篩選法(2)核酸分子雜交法

(3)限制性?xún)?nèi)切酶圖譜法(4)DNA序列測(cè)定法：雙脫氧終止法(5)目的基因表達(dá)產(chǎn)物測(cè)定法

12.外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式：

(1)胞內(nèi)表達(dá)：(a)非融合蛋白的胞內(nèi)表達(dá)：形成包涵體（B）融合蛋白的胞內(nèi)表達(dá)：在大腸桿

菌內(nèi)較穩(wěn)定（2）分泌表達(dá)：（a)分泌至周質(zhì)（b）分泌至胞外

11.外源基因在原核生物中表達(dá)的重要調(diào)控元件

(1)啟動(dòng)子：是DNA鏈上能與RNA聚合酶結(jié)合并起始mRNA合成的一段序列，是決定外源基

因在原核生物中表達(dá)效率的關(guān)鍵因素。(2)核糖體結(jié)合位點(diǎn)：SD序列(3)終止子

13.大腸桿菌中外源蛋白表達(dá)效率的影響因素：(1)外源基因密碼子：偏好密碼子（蛋白質(zhì)合成迅速，錯(cuò)配率低）和稀有密碼子(2)mRNA結(jié)構(gòu)：減少G、C含量，增加A、T含量(3)表達(dá)

載體：高拷貝數(shù)、適用范圍廣、穩(wěn)定性高、表達(dá)產(chǎn)物容易純化(4)外源蛋白穩(wěn)定性

14.分離純化技術(shù)應(yīng)滿(mǎn)足下列要求：(1)技術(shù)條件要溫和，能保持目的產(chǎn)物的生物活性；(2)選

擇性要好(3)回收率要高(4)兩個(gè)技術(shù)之間要能直接銜接(5)整個(gè)分離純化過(guò)程要快

15.基因重組蛋白的主要分離技術(shù)

(1)離心(2)沉淀(3)膜分離(4)雙水相萃取

16基因重組蛋白的主要純化技術(shù):

(1)離子交換層析(2)親和層析(3)凝膠過(guò)濾層析(4)反相層析和疏水層析

17.選擇分離純化方法的依據(jù)：

（元，層析分離次序的選擇也同樣重要。(3)根據(jù)分離純化工藝的要求來(lái)選擇(a)具有良好的穩(wěn)

定性、重復(fù)性和較高的安全性(b)盡可能減少組成工藝的步驟(c)分離純化工藝所用的時(shí)間要

盡可能的短(d)工藝和技術(shù)必須高效

18．基因工程藥物的質(zhì)量控制要點(diǎn)

(1)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定(2)蛋白質(zhì)純度檢測(cè)(3)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量測(cè)定(4)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)測(cè)定(5)蛋

白質(zhì)序列分析(6)內(nèi)毒素分析、宿主蛋白與核酸殘留分析

19.蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

(1)紫外吸收法(2)BCA法(3)Lowry法(4)考馬斯亮藍(lán)法(5)SDS-PAGE掃描分析法

20.蛋白質(zhì)純度的檢測(cè)：電泳法、層析法、質(zhì)譜法、末端氨基酸殘基分析法

21.蛋白質(zhì)Mr測(cè)定有SDS-PAGE法、凝膠層析法、質(zhì)譜法

22.蛋白質(zhì)等電點(diǎn)測(cè)定的常用方法：等電聚焦法。

23.蛋白質(zhì)序列的分析:N-端氨基酸序列分析，C-端氨基酸序列分析

根據(jù)體外培養(yǎng)時(shí)動(dòng)物細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)基質(zhì)的依賴(lài)性，可將動(dòng)物細(xì)胞分為

(1)貼壁依賴(lài)性細(xì)胞(2)非貼壁依賴(lài)性細(xì)胞(3)兼性貼壁細(xì)胞

1.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境條件

(1)培養(yǎng)溫度（哺乳類(lèi)37℃，昆蟲(chóng)25~28℃）(2)pH值（大多數(shù)7.2~7.4）(3)通氧量（一定量的CO2）(4)防止污染(5)基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(6)滲透壓

3.動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)特性

(1)比微生物細(xì)胞大得多，無(wú)細(xì)胞壁，抗機(jī)械強(qiáng)度低，對(duì)剪切力敏感，適應(yīng)環(huán)境能力差；(2)

倍增時(shí)間長(zhǎng)，生長(zhǎng)緩慢，正常二倍體細(xì)胞的生長(zhǎng)壽命是有限的；(3)對(duì)培養(yǎng)基要求高，易受

微生物污染，培養(yǎng)時(shí)需要添加抗生素；(4)生長(zhǎng)大多需貼附于基質(zhì)，相互粘連以集群形式存

在，并有接觸抑制現(xiàn)象；(5)多半將產(chǎn)物分泌在細(xì)胞外，便于收集和純化；(6)對(duì)蛋白質(zhì)的合成條件和修飾功能與細(xì)菌不同，動(dòng)物細(xì)胞可對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行完善的翻譯后修飾，特別是糖基化，與天然產(chǎn)品更一致，更適合于臨床應(yīng)用。

4.原代培養(yǎng)的主要步驟

(1)從健康動(dòng)物體內(nèi)無(wú)菌條件下取出適量組織，剪切成小薄片；(2)加入適宜濃度的胰蛋白酶

或膠原酶和EDTA等進(jìn)行消化作用使細(xì)胞分散；(3)將分散的細(xì)胞進(jìn)行洗滌并純化后，以2×

10^6~7×10^6 /ml的濃度加到培養(yǎng)基中，37℃下進(jìn)行原代培養(yǎng)，并適時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。分為

組織塊培養(yǎng)和單層細(xì)胞培養(yǎng)兩種方法。

5.動(dòng)物細(xì)胞深低溫保存的基本原理

在-70℃以下時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均已停止，即代謝處于完全停滯狀態(tài)，故可以長(zhǎng)期保存。

在不加任何條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會(huì)形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)

生機(jī)械損傷、電解質(zhì)濃度升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白質(zhì)變性等，能引起細(xì)胞

死亡。目前為了保存細(xì)胞，都采用液氮低溫（-196℃）凍存的方法。

6.動(dòng)物細(xì)胞的復(fù)蘇

其原則是快速融化，必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃，使細(xì)胞外凍

存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成損害。

7.動(dòng)物細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)要求特點(diǎn)

(1)碳源不能為無(wú)機(jī)物，大多為葡萄糖；(2)氮源不能為無(wú)機(jī)物，主要為各種氨基酸；(3)在很

多情況下尚需添加5%~20%的小牛血清或適量的動(dòng)物胚胎浸出液。

8.動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)方法

(1)懸浮培養(yǎng)法(2)微載體培養(yǎng)法(3)多孔載體培養(yǎng)法(4)微囊化培養(yǎng)法(5)中空纖維培養(yǎng)法

9.誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合的方法主要有:(1)病毒法(2)PEG法(3)電擊法(4)激光法

10.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器（整體掌握？）

(1)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器（藥用蛋白，如抗凝血Ⅲ、抗胰蛋白酶、葡萄糖苷酶、C蛋白）

(2)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物血液生物反應(yīng)器（人血紅蛋白、抗體或非活性狀態(tài)的融合蛋白）(3)轉(zhuǎn)基因動(dòng)

物尿液生物反應(yīng)器（促性腺激素）(4)轉(zhuǎn)基因雞（蛋）生物反應(yīng)器（人干擾素）

1.單克隆抗體技術(shù)的基本原理

基于動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)得以實(shí)現(xiàn)的，即骨髓瘤細(xì)胞和B細(xì)胞的融合。骨髓瘤細(xì)胞在體外

培養(yǎng)能大量無(wú)限增殖，但不能分泌特異性抗體；抗原免疫的B細(xì)胞能產(chǎn)生特異性抗體，但在體外不能無(wú)限增殖。將免疫B細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合后形成的雜交瘤細(xì)胞，繼承了兩個(gè)親代

細(xì)胞的特性，既具有骨髓瘤細(xì)胞能無(wú)限增殖的特性，又具有免疫B細(xì)胞合成和分泌特異性抗

體的能力。通常使用HAT（H為次黃嘌呤、A為氨基蝶呤、T為胸腺嘧啶核苷）選擇培養(yǎng)基

對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選。未融合的脾細(xì)胞因不能在體外長(zhǎng)期存活而死亡，未融合的骨髓瘤細(xì)

胞合成DNA的從頭合成途徑被培養(yǎng)基中的A阻斷，又因缺乏HGPRT（次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸

核糖轉(zhuǎn)移酶）和TK（胸腺嘧啶核苷激酶），不能利用培養(yǎng)基中的H和T完成DNA的合成過(guò)

程而死亡。只有融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾細(xì)胞獲得了HGPRT和TK，因此能在HAT培養(yǎng)基

中長(zhǎng)期存活與繁殖并分泌抗體。

2.單克隆抗體的大量制備主要方法:（1）體內(nèi)培養(yǎng)法（2）體外培養(yǎng)法

6.重組ScFv的應(yīng)用:(1)用于構(gòu)建和生產(chǎn)免疫毒素(2)用于腫瘤的影像分析和治療

7.噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的基本原理:用PCR技術(shù)從人免疫細(xì)胞中擴(kuò)增出整套的VH和VL基因，克隆到噬菌體載體上并以融合蛋白的形式表達(dá)在其外殼表面。這樣一來(lái)噬菌體DNA中有抗

體基因的存在，同時(shí)在其表面又有抗體分子的表達(dá)，可以方便地利用抗原-抗體特異性結(jié)合而篩選出所需要的抗體，并進(jìn)行克隆擴(kuò)增。

7.噬菌體抗體庫(kù)構(gòu)建過(guò)程

(1)從外周血或脾、淋巴結(jié)等組織中分離B細(xì)胞，提取mRNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA；

(2)應(yīng)用抗體輕鏈和重鏈引物，根據(jù)建庫(kù)的需要通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增不同的抗體基因片段；

(3)構(gòu)建噬菌體載體；(4)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌，構(gòu)建全套抗體庫(kù)。

通過(guò)多輪的抗原親和吸附（結(jié)合）-洗脫-擴(kuò)增，最終篩選出抗原特異的抗體克隆。其中，噬

菌體抗體庫(kù)的篩選是關(guān)鍵環(huán)節(jié)和步驟。

減毒活疫苗的優(yōu)缺點(diǎn)：

優(yōu)點(diǎn)：

（1）通過(guò)自然感染途徑接種，可以誘導(dǎo)包括體液免疫、細(xì)胞免疫和粘膜免疫在內(nèi)的更全面的免疫應(yīng)答，使機(jī)體獲得更廣泛的免疫保護(hù)；（2）由于使用的是活的微生物他們可以在體內(nèi)

長(zhǎng)時(shí)間起作用而誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，且由于活的微生物有增殖的特性，理論上只需要接

種一次，即可達(dá)到滿(mǎn)意的免疫效果；（3）可能引起水平傳播擴(kuò)大免疫效果，增強(qiáng)群體免疫屏

障；(4)一般不需要再疫苗中添加佐劑，生產(chǎn)工藝一般不需要濃縮純化，價(jià)格低廉。

缺點(diǎn)：

(1)一般減毒活疫苗均保留一定殘余毒力，對(duì)一些個(gè)體如免疫缺陷者可能誘發(fā)嚴(yán)重疾病，并

且由于種種原因如基因修飾等，減毒活疫苗可能出現(xiàn)毒力回復(fù)即“返祖”現(xiàn)象；(2)減毒活

疫苗是活的微生物制劑，可能造成環(huán)境污染而引發(fā)交叉感染等，并可能滯留在環(huán)境中形成傳

染源；(3)缺損顆?？赡芨蓴_免疫效果，因此產(chǎn)品分析評(píng)估較為困難；(4)保存運(yùn)輸?shù)葪l件要

求較高，如需冷藏等。

1.滅活疫苗的特點(diǎn)：(1)滅活疫苗常需多次接種；(2)接種滅活疫苗產(chǎn)生的抗體滴度隨著時(shí)

間而下降；(3)滅活疫苗需要量大。

第七章 發(fā)酵工程制藥

1.發(fā)酵類(lèi)型：(1)微生物菌體發(fā)酵(2)微生物的酶(3)微生物的代謝產(chǎn)物發(fā)酵(4)微生物轉(zhuǎn)化發(fā)

酵(5)生物工程菌發(fā)酵

2.微生物發(fā)酵生產(chǎn)藥物的分類(lèi)：(1)抗生素類(lèi)(2)氨基酸類(lèi)(3)核苷酸類(lèi)(4)維生素類(lèi)(5)甾體類(lèi)

激素(6)多糖類(lèi)(6)治療酶及酶抑制劑

3.菌種保藏方法：(1)斜面低溫保藏法(2)石蠟油封存法(3)沙土管保藏法(4)麩皮保藏法(5)甘

油懸液保藏法(6)冷東真空干燥保藏法(7)液氮超低溫保藏法(8)宿主保藏法

4.種子液具備的條件：(1)菌種的生長(zhǎng)活力強(qiáng)，轉(zhuǎn)種至發(fā)酵罐后能迅速生長(zhǎng)，延遲期短；(2)

生理狀態(tài)穩(wěn)定；(3)菌體總量及濃度能滿(mǎn)足大容量發(fā)酵罐的要求；(4)無(wú)雜菌污染，保證純種培養(yǎng)；()保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力

5.微生物的發(fā)酵方式：（1）分批發(fā)酵（2）補(bǔ)料—分批發(fā)酵（3）半連續(xù)發(fā)酵（4）連續(xù)發(fā)酵

5.發(fā)酵過(guò)程的中間分析項(xiàng)目：（1）產(chǎn)物產(chǎn)量（2）PH值（3）糖（4）氨基氮（5）菌絲形

態(tài)

6.發(fā)酵過(guò)程的影響因素及控制：（1）菌體濃度的影響及控制（2）營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)發(fā)酵的影響

及控制（3）溫度的影響及控制（4）PH的影響及控制（5）溶氧的影響及控制（6）二氧化碳的影響及控制（7）泡沫的影響及控制（8）染菌對(duì)發(fā)酵的影響

第四篇：制藥實(shí)驗(yàn)總結(jié)

1、溶液1，2，3，的作用？

溶液Ⅰ的作用：懸浮大腸桿菌菌體，而且加溶液I后，必須要將菌體懸浮徹底，不得有塊狀大顆粒狀呈現(xiàn)，是質(zhì)粒DNA提取的首要關(guān)鍵。且其中含有的溶霉菌可以水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌作用。

溶液

2、提供堿性條件，在NaOH與SDS的共同作用下使大腸桿菌瞬間裂解，并變性核DNA。當(dāng)細(xì)胞懸浮于NaOH和十二烷基酸鈉（SDS）溶液中使，在高pH（堿性環(huán)境）的作用下細(xì)胞發(fā)生裂解，此外蛋白質(zhì)和染色體DNA發(fā)生變性與細(xì)胞碎片一起沉淀下來(lái)。溶液3：（醋酸鉀和醋酸），該溶液所含有的高濃度鉀離子與溶液體系中的十二烷基硫酸鈉（即SDS與NaOH所形成的可溶性物質(zhì)）發(fā)生反應(yīng)形成十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate,PDS），從而將與之結(jié)合的絕大部分大腸桿菌蛋白質(zhì)以及很長(zhǎng)的基因組DNA一起沉淀沉淀，與質(zhì)粒分離開(kāi)來(lái)；中和氫氧化鈉使質(zhì)粒DNA復(fù)性。

因?yàn)榛蚪MDNA太長(zhǎng)了，長(zhǎng)長(zhǎng)的DNA自然容易被PDS給共沉淀了，盡管SDS并不與DNA分子結(jié)合。

2、各試劑的作用？ 溶液

1、葡萄糖的作用是使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)很快沉積到管子的底部，增加溶液的粘度，維持滲透壓及防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+ 和Mg2+等二價(jià)金屬離的螯合劑，在溶液I中加入EDTA，是要把大腸桿菌細(xì)胞中的二價(jià)金屬離子都螯合掉，從而起到抑制 DNase對(duì)DNA的降解和抑制微生物生長(zhǎng)的作用。另外也可保證溶菌酶活性。任何生物化學(xué)反應(yīng)，首先要控制好溶液的pH，因此用適當(dāng)濃度的和適當(dāng)pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不過(guò)的了

溶液

2、提供堿性條件，在NaOH與SDS的共同作用下使大腸桿菌瞬間裂解，并變性核DNA。當(dāng)細(xì)胞懸浮于NaOH和十二烷基酸鈉（SDS）溶液中使，在高pH（堿性環(huán)境）的作用下細(xì)胞發(fā)生裂解，此外蛋白質(zhì)和染色體DNA發(fā)生變性與細(xì)胞碎片一起沉淀下來(lái)。溶液

3、醋酸中和堿。

25/24/1的酚/氯仿/異戊醇：

A．水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液，離心后酚相會(huì)跑到上層，不利于含質(zhì)粒的水相的回收；加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；

B．酚與水有很大的互溶性，如果單獨(dú)用酚抽提后會(huì)有大量的酚溶解到水相中，而酚會(huì)抑制很多酶反應(yīng)。而且含質(zhì)粒DNA的水相會(huì)部分進(jìn)入到酚中，造成損失！C．添加異戊醇，主要是為了讓離心后上下層的界面更加清晰，方便了水相的回收。

無(wú)水乙醇：回收后的水相含有足夠多的鹽，DNA在無(wú)水乙醇中的溶解度小，因此只要加入2倍體積的乙醇，在室溫放置幾分鐘后離心就可以將質(zhì)粒DNA沉淀出來(lái)。70%乙醇：如果感覺(jué)發(fā)生了鹽的沉淀，就用70％的乙醇多洗幾次。（除鹽），3、注意事項(xiàng)

（2）用不新鮮的0.4 M NaOH，即便有SDS也無(wú)法有效溶解大腸桿菌。因此必須使用新鮮的0.4 M NaOH試劑進(jìn)行配制。

（3）SDS易產(chǎn)生氣泡，不要?jiǎng)×覕嚢琛＃?）變性時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。

（5）用移液器操作時(shí)一定要小心，特別是加入溶液二、三后一定不要?jiǎng)×艺鹗?，以免切碎DNA。

質(zhì)粒DNA的酶切鑒定及瓊脂糖凝膠電泳

1、限制性核酸內(nèi)切酶的特性，在基因工程中的作用？ 特性（基因工程）、定義。

作用基因工程的重要工具，能切割DNA獲得目的基因，切割質(zhì)粒留下連接位點(diǎn)。此外，雙切酶能保證基因的定向插入，提高重組率。產(chǎn)生粘性末端惑平末端。

目前, 基因工程上, 限制酶主要應(yīng)用于以下兩方面

（1）目的基因與載體的重組

細(xì)菌細(xì)胞中的限制酶能水解外源DNA , 因此必須通過(guò)適當(dāng)?shù)妮d體(質(zhì)粒或噬菌體)的幫助才能將外源DNA引人受體細(xì)胞并在其中增殖和表達(dá)。將供體DNA與載體用同樣的限制酶處理, 使載體帶上各種各樣的外源DNA片斷, 然后引人受體細(xì)菌細(xì)胞增殖, 菌細(xì)胞增殖, 再篩選出所需的菌株, 便獲得帶有某一目的基因的繁殖系.用這種方法, 已成功地將酵母菌的咪哇甘油磷酸脫水酶基因、夕一異丙基蘋(píng)果酸脫氫酶基因和色氨酸合成酶基因通過(guò)幾噬菌體轉(zhuǎn)人大腸桿菌。2）建造新的基因載體作為基因載體,在引人受體細(xì)胞后, 必須有較高的復(fù)制率, 以求獲得大量的基因產(chǎn)物；必須具備一個(gè)選擇性標(biāo)志, 以便篩選；還要有一至多種限制酶的作用位點(diǎn)（每種酶只有一個(gè)切口）；

2、瓊脂糖凝膠電泳的注意事項(xiàng)?

一、配膠：

1、電子稱(chēng)的使用，要時(shí)刻保持電子稱(chēng)的精確性，清潔性，根據(jù)不同濃度的膠配置瓊脂糖。

2、加TAE的量要適當(dāng)，以免配出的膠太薄導(dǎo)致膠孔太淺或濃度太低。

3倒膠前，膠托要洗干凈，并擦干，倒膠時(shí)要待膠冷到一定溫度搖勻，盡量不要產(chǎn)生氣泡。若膠的溫度過(guò)高要頂著膠托，防止膠變形。

二、點(diǎn)樣電泳

1孔板要干凈，loading點(diǎn)樣要均勻，控制1~2ul的量，并做好對(duì)應(yīng)標(biāo)記。2點(diǎn)樣后及時(shí)蓋上膠墊注意不要蓋反。

5加樣時(shí)槍頭要上緊，吸樣均勻準(zhǔn)確，排液時(shí)槍頭不要有殘留

3點(diǎn)電泳前要檢查膠是否合格，點(diǎn)樣要對(duì)準(zhǔn)膠孔，盡量點(diǎn)完所有的樣。4不要忘記點(diǎn)marker并擺正膠位，正負(fù)極不要接反。

三、EB染色

1切膠要準(zhǔn)，取膠要穩(wěn)，泡膠要慎以免EB濺起。2碰到EB的手套要及時(shí)丟棄 3 EB要適時(shí)更換，盤(pán)子及時(shí)清洗 4抹布要分清，不可交叉使用。

四、圖像分析儀的使用

1使用前要清潔，避免影響膠圖清新度。2 照膠時(shí)應(yīng)經(jīng)量減少開(kāi)紫外燈的時(shí)間。

5觀察時(shí)要帶防護(hù)眼鏡，避免眼睛被紫外損傷。

3拍照時(shí)先關(guān)攝像頭再關(guān)紫外燈，嚴(yán)格按照照膠流程操作。4照好的膠要及時(shí)丟棄。

3、膠回收試劑盒在回收DNA時(shí)各試劑的作用？ PCR

一、降低退火溫度對(duì)反映有何影響？

1在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。

2如果溫度過(guò)低，擴(kuò)增特異性差，雜帶較多，背景深。PCR擴(kuò)增在變性階段吸熱,在退火和延伸階段放熱,每一個(gè)PCR循環(huán)呈現(xiàn)放熱效應(yīng),同時(shí)退火溫度高導(dǎo)致平臺(tái)期的前移和焓值的降低，4、退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度。

二、延長(zhǎng)變性時(shí)間對(duì)反映有何影響？

變性時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致酶活性的降低。

GC含量過(guò)高的片段，可以適當(dāng)延長(zhǎng)變性時(shí)間。

三、循環(huán)次數(shù)是不是越多越好？

不是的，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，酶會(huì)逐漸失活、dNTP等原料會(huì)逐漸消耗掉。

PCR敏感性太高,循環(huán)過(guò)多容易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，比方說(shuō)把試劑中原本極其微量的雜質(zhì)序列片段放大擴(kuò)增，影響對(duì)正常結(jié)果的判斷。

因此在一定范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，產(chǎn)物會(huì)增多；但超過(guò)了就不好了。一般設(shè)置30-35個(gè)循環(huán)就很夠了

四、PCR的五大元素？

參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物：

引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：

①引物長(zhǎng)度： 15-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。

③引物堿基：G+C 含量，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免核苷酸的成串排列。

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3'端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。

⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。引物量：引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。

(2)酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2。5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí))，濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少。

(3)dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，將其PH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解。尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過(guò)低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。(4)模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K 來(lái)消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是： 溶解細(xì)胞膜上的脂類(lèi)與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀； 蛋白酶K 能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K 法，要防止RNase降解RNA。

(5)Mg2+濃度 Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，Mg2+濃度過(guò)高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。酵母菌原生質(zhì)體的分離與再生

高壓蒸汽滅菌的注意事項(xiàng)？（微生物實(shí)驗(yàn)）

第一，無(wú)菌包不宜過(guò)大(小于50cm×30cm×30cm)，不宜過(guò)緊，各包裹間要有間隙，使蒸汽能對(duì)流易滲透到包裹中央。消毒前，打開(kāi)貯槽或盒的通氣孔，有利于蒸汽流通。而且排氣時(shí)使蒸汽能迅速排出，以保持物品干燥。消毒滅菌完畢，關(guān)閉貯槽或盒的通氣孔，以保持物品的無(wú)菌狀態(tài)。

第二，布類(lèi)物品應(yīng)放在金屬類(lèi)物品上，否則蒸汽遇冷凝聚成水珠，使包布受潮。阻礙蒸汽進(jìn)入包裹中央，嚴(yán)重影響滅菌效果。

⑥瓶裝液體滅菌時(shí)，要用玻璃紙和紗布包扎瓶口；如有橡皮塞時(shí)，應(yīng)插入針頭排氣；⑦應(yīng)有專(zhuān)人負(fù)責(zé)，每次滅菌前，應(yīng)檢查安全閥的性能，以防壓力過(guò)高發(fā)生爆炸，保證安全使用；

第五篇：制藥企業(yè)質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)管理淺論 吳軍

風(fēng)險(xiǎn)管理，就是一個(gè)美麗的謊言

吳軍

各位好！

關(guān)于風(fēng)險(xiǎn)分析，我還是有要對(duì)其他網(wǎng)友交流一下: 在2010版GMP實(shí)施之前，我對(duì)國(guó)內(nèi)合資企業(yè)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)管理實(shí)施情況進(jìn)行了調(diào)查，基本上都是我們國(guó)內(nèi)合資企業(yè)排名在前十位的企業(yè)，調(diào)查的結(jié)果讓我大吃一驚，這些企業(yè)并沒(méi)用像ICH Q9那樣進(jìn)行廣泛的風(fēng)險(xiǎn)管理應(yīng)用，也只是在個(gè)別管理環(huán)節(jié)上應(yīng)用了風(fēng)險(xiǎn)管理結(jié)果，這是為什么？他們是真正的將風(fēng)險(xiǎn)管理的理念濃縮到日常的工作分析和思維工作中，并不是簡(jiǎn)單的形式主義。首先我聲明是曾多次說(shuō)過(guò)《風(fēng)險(xiǎn)管理，就是一個(gè)美麗的謊言》，但版主不知道我說(shuō)的話(huà)的前后背景，以及我所表達(dá)的真實(shí)含義，認(rèn)為我的話(huà)有些偏激，個(gè)別人還認(rèn)為我是謬論，感覺(jué)網(wǎng)友對(duì)我講的話(huà)還是有些誤解，還是我做些解釋?zhuān)?/p>

1）GMP本身就是以風(fēng)險(xiǎn)控制為目標(biāo)的法規(guī)，它是將藥品制造過(guò)程，過(guò)程存在的風(fēng)險(xiǎn)的控制手段，規(guī)定了最基本的要求，并不能說(shuō)2010版GMP提出了風(fēng)險(xiǎn)管理的概念和要求，就認(rèn)為2010版GMP里面把風(fēng)險(xiǎn)管理作為主要的實(shí)施要求，并不能將風(fēng)險(xiǎn)管理作為實(shí)施GMP一個(gè)玄學(xué)的手段，大講特講風(fēng)險(xiǎn)管理，認(rèn)為新版GMP的一切就是風(fēng)險(xiǎn)管理，這跟2010版GMP起草增加風(fēng)險(xiǎn)管理的初衷不符。將風(fēng)險(xiǎn)管理作為混淆GMP的內(nèi)涵，其本身就是一個(gè)美麗的謊言。

2）從風(fēng)險(xiǎn)管理理論的發(fā)展歷史來(lái)看，它是系統(tǒng)工程中一個(gè)重要的理論分支，其主要是研究目標(biāo)、約束條件不確定時(shí)，進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)危害、資源與目標(biāo)如何平衡而進(jìn)行決策的重要思維方法和手段。但在藥品生產(chǎn)過(guò)程中，其大部分的風(fēng)險(xiǎn)是顯而易見(jiàn)。開(kāi)展風(fēng)險(xiǎn)分析之前首先要明確的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估目標(biāo)，不能盲目的為風(fēng)險(xiǎn)分析而風(fēng)險(xiǎn)分析，并不需要事事都需要風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，更不能將風(fēng)險(xiǎn)分析的結(jié)果作為借口，將不合理、不科學(xué)的方法變成合情合理的實(shí)施方法。這風(fēng)險(xiǎn)運(yùn)用在結(jié)果，也將風(fēng)險(xiǎn)管理變成了一個(gè)美麗的幌子。3）一個(gè)有效的風(fēng)險(xiǎn)分析，并不是為風(fēng)險(xiǎn)分析而風(fēng)險(xiǎn)分析，但現(xiàn)在的現(xiàn)狀是什么，2010版GMP的實(shí)施，一切好像都是為了風(fēng)險(xiǎn)管理而進(jìn)行，給人一個(gè)感覺(jué)，好像搞了風(fēng)險(xiǎn)管理就好像水平上升的一個(gè)層次，好像做了風(fēng)險(xiǎn)管理就視乎一切產(chǎn)品缺陷、體系缺陷的問(wèn)題都解決了。GMP的核心是什么？藥品生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，如工藝、清潔與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與方法的控制這些最最關(guān)鍵的內(nèi)容，沒(méi)有人去關(guān)心和改進(jìn)，都沉迷于無(wú)效的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估報(bào)告中，讓人迷失了我們實(shí)施GMP的目的是什么，用風(fēng)險(xiǎn)管理代替了GMP的一切，這本身就是一個(gè)美麗的幌子。

4）一個(gè)好的風(fēng)險(xiǎn)分析是基于科學(xué)與經(jīng)驗(yàn)的專(zhuān)業(yè)人員來(lái)進(jìn)行有效的識(shí)別、分析與評(píng)價(jià)，但大部分的企業(yè)、人員都是只看分析文件的格式，并沒(méi)有體會(huì)到風(fēng)險(xiǎn)分析的內(nèi)涵：樹(shù)立風(fēng)險(xiǎn)的意思、建立系統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)管理的思維和工作方法。風(fēng)險(xiǎn)管理的背后，是通過(guò)風(fēng)險(xiǎn)的識(shí)別與分析，找出管理的缺陷，建立系統(tǒng)的解決問(wèn)題的手段，其核心GMP技術(shù)基礎(chǔ)的建立，并不是為風(fēng)險(xiǎn)分析而進(jìn)行一切的空對(duì)空的文件。現(xiàn)在所做的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估文件也僅僅是表明文章，其評(píng)估的結(jié)果也是美麗的謊言。上述的解釋?zhuān)彩轻槍?duì)制藥企業(yè)在實(shí)施GMP時(shí)“教條主義”和“機(jī)會(huì)主義”的批評(píng)而談的一些個(gè)人看法，如有不妥之處，歡迎各位多指正！

吳軍 2011-11-20 附原文：

首先個(gè)人覺(jué)得有必要澄清幾個(gè)概念：

1、風(fēng)險(xiǎn)分析不等于風(fēng)險(xiǎn)管理，這個(gè)本人在很多帖子都在澄清。風(fēng)險(xiǎn)分析或風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，可以理解為一種純粹的工具或是技術(shù)，風(fēng)險(xiǎn)管理則不同，不僅僅是工具或者技術(shù)，而是一種管理方式或管理理念。

2、GMP體系和質(zhì)量體系的概念，很多時(shí)候也是容易誤解的。很多人都會(huì)把GMP當(dāng)做一種體系，甚至認(rèn)為只要搞了GMP，質(zhì)量管理就能做好了。這點(diǎn)新版GMP指南已經(jīng)有了澄清，就是那幾個(gè)大圈小圈的關(guān)系。個(gè)人認(rèn)為GMP只能稱(chēng)之為規(guī)范，離體系還有一定的距離，如果大家能夠理解這點(diǎn)，就明白為什么ICH 要出臺(tái)個(gè)ICH Q10了。

3、GMP和風(fēng)險(xiǎn)管理的關(guān)系，一定不要去應(yīng)扯上太多關(guān)系，個(gè)人的理解是，GMP那些條款，可以理解成是對(duì)現(xiàn)有制藥質(zhì)量各系統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估后的風(fēng)險(xiǎn)控制措施的匯總。GMP主要還是針對(duì)生產(chǎn)相關(guān)的過(guò)程的，強(qiáng)調(diào)的是一種規(guī)范，那么有規(guī)范就要建立規(guī)范，這個(gè)規(guī)范的建立以前是基于經(jīng)驗(yàn)或者懵懂中應(yīng)用的風(fēng)險(xiǎn)管理?，F(xiàn)在隨著行業(yè)的發(fā)展，可以基于科學(xué)和風(fēng)險(xiǎn)管理來(lái)建立這種規(guī)范了。本人在以前的帖子中也提出過(guò)GMP建設(shè)的觀點(diǎn)，正是基于此種想法。如何建立GMP規(guī)范，其中有兩個(gè)管理工具：風(fēng)險(xiǎn)管理和知識(shí)管理，再結(jié)合現(xiàn)在已有的驗(yàn)證。

4、風(fēng)險(xiǎn)管理在新版GMP中的作用。新版GMP開(kāi)始強(qiáng)調(diào)質(zhì)量體系了。在建立基于新版GMP思想的質(zhì)量體系的過(guò)程中，個(gè)人認(rèn)為風(fēng)險(xiǎn)管理可以起到優(yōu)化原有質(zhì)量體系的作用。舉個(gè)很簡(jiǎn)單的例子：如果優(yōu)化現(xiàn)有的文件體系？就可以采用基于風(fēng)險(xiǎn)的方法，對(duì)現(xiàn)有的文件進(jìn)行分析，看看那些文件是必要的，考慮一下，這個(gè)文件如果增刪，會(huì)帶來(lái)什么風(fēng)險(xiǎn)？如果刪除有很高的風(fēng)險(xiǎn)，再分析文件內(nèi)容，那些內(nèi)容的增刪會(huì)帶來(lái)什么風(fēng)險(xiǎn)，這樣看似比較復(fù)雜的分析，可以很大程度上優(yōu)化咱們的文件結(jié)構(gòu)。附原提問(wèn)：

吳軍老師說(shuō)“風(fēng)險(xiǎn)分析，就是美麗的謊言！”（不知前后語(yǔ)境，也許有斷章取義之嫌）首先，風(fēng)險(xiǎn)管理的理念是科學(xué)的，而且廣泛地應(yīng)用于其它行業(yè)

事實(shí)上，我們?cè)谶^(guò)去的工作期間，都在自覺(jué)不自覺(jué)地進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分析，只不過(guò)是沒(méi)有形成系統(tǒng)地、科學(xué)的分析體系

對(duì)于國(guó)內(nèi)制藥行業(yè)來(lái)說(shuō)，風(fēng)險(xiǎn)分析是一個(gè)新的名詞，由于對(duì)它熟悉的不多，在某些場(chǎng)合上，成了偽專(zhuān)家的萬(wàn)能公式，因此也引起許多人的反感（包括本人）。

一個(gè)好的風(fēng)險(xiǎn)分析需要有一批有高度責(zé)任心，具豐富理論知識(shí)與實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的人來(lái)進(jìn)行，更重要的時(shí)需要?dú)v史數(shù)據(jù)及經(jīng)驗(yàn)的支持。

由于辦內(nèi)大部分制藥行業(yè)管理相對(duì)落后，尤其是在設(shè)備管理方面人員稀缺，而且對(duì)歷史數(shù)據(jù)沒(méi)有很好的總結(jié)，這給風(fēng)險(xiǎn)分析帶來(lái)很大的困難。

所以，就目前來(lái)說(shuō)，大部分藥企的風(fēng)險(xiǎn)分析確實(shí)是意義不大的，但這并不意味著做這項(xiàng)工作沒(méi)有必要，正如GMP在實(shí)施之前，基本都是照葫蘆畫(huà)瓢，與真正的GMP相差十萬(wàn)八千里，但經(jīng)過(guò)多年的努力，現(xiàn)在應(yīng)該說(shuō)GMP對(duì)制藥管理起到了相當(dāng)大的促進(jìn)作用。所以我相信眼前的沒(méi)有意義的風(fēng)險(xiǎn)分析，將為今后的科學(xué)的風(fēng)險(xiǎn)分析體系奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。